噬菌体和粘粒载体

2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等

包装容量
• λ噬菌体载体可插入长 噬菌体载体可插入长5-20kb的外来 的外来DNA，这 噬菌体载体可插入长 的外来 ， 比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装 长得多； 比质粒载体能插入的 长得多 的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建 效率高得比质粒载体复杂。 • 理论上的极限值可达 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有 ， 效的克隆范围仅为15kb左右 效的克隆范围仅为 左右
（3）外源片断与载体的连接 ） • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 联体，以利于将两个cos位点之间的片断 联体，以利于将两个 位点之间的片断 装入噬菌体颗粒
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染 ）重组噬菌体的体外包装， 力的噬菌体颗粒 • 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 利用特殊材料， • 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成 连接产物与包装蛋白混合时， 包装反应， 包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 • 包装蛋白对所包装的 包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选 大小有高度选 择性， 范围： 分子的75％－ ％ 择性， 范围：λDNA分子的 ％－ 分子的 ％－105％
基因克隆载体 (λ噬菌体载体 噬菌体载体) 噬菌体载体
• 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形， 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头 部和尾部两部分组成。 部和尾部两部分组成。 • 头部 核心：核酸（ 核心：核酸（DNA或RNA） 或 ） 衣壳：蛋白质， 衣壳：蛋白质，六边形立体对称 • 尾部 蛋白质 尾部( 蛋白质) 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、尾刺 与吸附宿主有关

M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在 体外进行纯化和操作。 无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正 好与λ噬菌体相反，所以M13噬菌体并不存在包装限制的问 题。
5、便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。
6、不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能 形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。
利 用 质 粒 进 行 克 隆
“柯斯克隆” 原理及步骤 1．分离外源DNA片段35～45kb
2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同
M13 DNA载体的构建
M13mp 载体系列
插入一段lac DNA 片段，即带有-半 乳糖苷酶基因(lacZ) 的调控序列及其N 端头146个aa编码 信息，宿主F’因 子携带缺失第1141位氨基酸的lacZ’
M13 DNA载体的特点
1、克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体 细胞外，在DNA定向突变中非常有用. 2、M13重组体筛选简便 可以利用菌落的蓝白斑筛选转染的转化子 3、制备的单链DNA、双链RF-DNA M13噬菌体， 不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。
（二）柯斯质粒的特点
1、具有λ噬菌体的特性。 具有cos位点，能像 λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 2、具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内 自由复制，以质粒DNA的形式存在于细胞内。 3、 具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或 λ-DNA大得多的外源DNA片段，40kb。 4、 便于筛选：携带质粒的选择标记 。
大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA

1
逆转录酶为依赖 RNA的 DNA聚合酶，具有 5’ 3’
2
聚合酶活性外，以 RNA为模板合成 DNA。
3
逆转录酶还具有核糖核酸酶H (RNase H) 活性，可
4
从 5’ 末端或 3’ 末端降解RNA:DNA杂合链中的
5
RNA。
6
依赖 DNA的 DNA聚合酶
7
逆转录酶无 3’ 5’ 外切酶活性。
8
禽类逆转录酶和鼠类逆转录酶的比较
以 mRNA为模板合成第一条 cDNA链，所用的引物包括 Oligo (dT)12-18 特定序列的寡核苷物 克隆特定的 cDNA：用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR：用特定序列的寡核苷酸引物 制备 cDNA 探针：用特定序列的寡核苷酸引物或 随机序列的寡核苷酸引物
A
C
C
C
5'
DNA连接酶
基因工程 (Genetic engineering)
(Central dogma)
基因 (Gene) 能编码一条多肽链并具有一定长度的 DNA 分子。 基因组 (Genome) 一种生物全部染色体的遗传物质的总和，以全长 DNA 的碱基对 (bp) 数目表示。
5’ 凸端 (5’ overhang) 粘性末端
3’ 凸端 (3’ overhang) 粘性末端
CCCGGG GGGCCC
5’ - 3’ -
-3’ -5’
5’ - 3’ -
- OH 3’ - P 5’
CCC GGG
GGG CCC
5’ P - 3’ OH-
-3’ -5’
SmaI
-3’ -5’
细菌基因组 大肠杆菌： 4 x 106 bp
人类基因组：3 x 109 bp