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第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体

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第一章1-6噬菌体载体2

第一章1-6噬菌体载体2

3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。

•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。

第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。

•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。

用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。

•该载体克隆效率很高。

•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。

•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。

Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。

筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。

反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。

•核酸探针杂交。

Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

噬菌体和粘粒载体-西北师范大学

噬菌体和粘粒载体-西北师范大学

基因工程 ５.1.２噬菌体的生命周期
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
5.1.２.１ 噬茵体的溶菌生命周期
裂解寄主细胞，释放子代噬菌 体的生命周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体 叫做烈性噬菌体。
溶菌生长周期之间的共同特征：
1 吸附： 2 注入： 3 转变： 4 合 成：5 组装：6 释放：
西北师范大学 精品课程 武国凡
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
超感染的λ噬菌体DNA将会发生什么样的变化呢？ 这种DNA可形成超盘旋的结构，由于处在超盘旋结构状
态的λDNA复制基因很难进行复制，而细菌细胞却没有受
到影响，仍能正常地生长和分裂，结果经过若干世代之 后，在细菌细胞群体中，感染的DNA分子便逐渐地被稀
DNA、 单 链 环 形 DNA、 单 链 线 性
DNA以及单链RNA等多种形式。
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程 5.1.1.2 噬菌体的感染性
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
少量噬菌体感染高浓度寄主细胞后，涂板，结果在平板上， 以最初被感染的细胞为中心，形成大量的噬菌斑。
西北师范大学 精品课程 武国凡
释掉了。
西北师范大学 精品课程 武国凡
基因工程 5.1.2.3 异源免疫性
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
有些温和噬菌体，如噬菌体 21 和 434 ，各自具有自身的 免疫体系，具有自身的阻遏基因和操纵基因。因此，其阻 遏物不能同λ的操纵基因结合；反过来，λ的阻遏物，也不 能够同21和434 噬菌体的操纵基因结合。这样的一对噬菌 体，互称为异源免疫性。 温和噬菌体可以在异源免疫性的溶源性细菌的菌苔上形 成噬菌斑。 噬菌体DNA的免疫性区段（包括cI基因、操纵基因和启 动基因），以imm表示，如immλ、imm21和imm434等。

第八讲单链菌体载体及噬菌粒载体

第八讲单链菌体载体及噬菌粒载体

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

第一章1-6噬菌体载体2

第一章1-6噬菌体载体2

3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。

•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。

•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。

第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。

•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。

用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。

•该载体克隆效率很高。

•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。

•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。

Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。

筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。

反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。

•核酸探针杂交。

Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。

基因克隆主要载体系统

基因克隆主要载体系统

SV40病毒
SV40病毒，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3 构成。 受纳细胞（permissive cell， 也称允许细胞 ）： 能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生 感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生 癌变。 基因结构:
3 、载体的共同特征（或应具备的条 件）：
①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切 位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单 一酶切位点 ④有选择标记基因 ⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、 终止子,SD序列） ⑥具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散
5.其他载体
（1）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC） （2）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） （3）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、 腺病毒相关病毒、逆转录病毒）
三 真核细胞的克隆载体
二、植物表达载体
多数植物表达载体是质粒载体
最经典的植物表达载体是pBI121
植物表达载体与克隆质粒载体一样, 可以 克隆基因, 但还具备表达所克隆的基因的 特性
(15kb)
三、动物细胞基因克隆的载体
㈠SV40病毒 ㈡SV40病毒载体
(1)取代型重组病毒载体 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体
附加体型载体（YEP）
YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色 体的选择标记构成。 2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列 能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们 已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体PYF92就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒 和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105 转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高 （25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。

噬菌体载体

噬菌体载体

第三章噬菌体载体一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。

2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。

3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。

在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。

它有一个复制起点，进行—-------—向复制。

λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。

其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。

这种黏性末端可以自然成环。

成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。

4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。

5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。

6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。

从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。

8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。

9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，(3)———————————。

10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。

载体介绍

载体介绍
7
8
λ噬菌体载体举例：λgt10 载体
9
λ噬菌体载体举例：λEMBL3
10
λ噬菌体载体主要特点
主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大
仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建，也经常用 于外源目的基因的克隆。
贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷
贝数多（10-200个）。
32
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid) 非接合型（non-conjugative plasmid)
2. F质粒(y factor)
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
15
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
16
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
17
pUC118 (MCS)
pUC119 (MCS)
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
30
质粒给宿主细胞的标记
1.氨苄青霉素 (Ampicillin ) 2.卡那霉素 (Kanamycin) 3. 四环素（Tetracycline） 4. 氯霉素(Chloramphenicol) 5. 链霉素（Streptomycin） 6. 潮霉素（Hygromycin ）
31
质粒的复制类型
据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： 1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷

基因工程载体噬菌体载体课件

基因工程载体噬菌体载体课件

•24
（左右臂连接）
（三段自身连接） （插入片段）
•基因工程载体噬菌体载体
•25
（三）体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将
重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感
染方式导入细胞的频率可达 106~108/μgDNA，而以转染（translation） 的方式导入的频率仅为103~105/ μgDNA。
特点是功能相近的基因在基 因组中聚集在一起。
•基因工程载体噬菌体载体
•12
λ噬菌体
组成特点：
双链线状DNA分子，
全长50kb，
含65个基因，
在其分子两端各含有12
个碱基的互补单链，是天
然的粘性末端，被称为
COS位点。
•基因工程载体噬菌体载体
•13
λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长
溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿
主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体 颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway)
噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中 去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。
•基因工程载体噬菌体载体
•14
噬菌体
•41
•基因工程载体噬菌体载体
•42
Phage M13 replication in the host cell: Nicked by gene 2 protein
RNA pol +
RF DNA polIII
±
+

第一章1-5噬菌体载体

第一章1-5噬菌体载体
15
4个操纵子：
• 阻遏蛋白操纵子：cI • 左右两个早期操纵子：复制酶、重组基因、 调节基因（cro、N、cⅡ、cⅢ和Q） • 晚期操纵子：裂解基因、头部和尾部蛋白 基因 • L链：左向转录链 • R链：右向转录链
16
cI，cro、N、cⅡ、cⅢ和Q，头尾和裂解基因 在基因组中的位置
• Figure. The genetic map of the λ phage. The positions of nonlethal and conditionally lethal mutations are indicated, and the characteristic clusters of genes with related functions are shown.
假单胞菌
一、λ噬菌体
7
（一）λ噬菌体
1、λ噬菌体特征： • λ噬菌体由头和尾构成。 • 基因组是长约50kb的线性双链DNA分子， 末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端) 。 • DNA组装在头部蛋白质外壳内部，其序列 已全部测出。 • λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA 注入E coli，而将其蛋白质外壳留在菌外。
第一章
分子克隆的工具酶和载体
• 第八节 噬菌体载体
1
噬菌体载体
• 噬菌体（phage）：是感染细菌的一类病 毒。有的噬菌体基因组较大，λ噬菌体 和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、 fd噬菌体等。 • 用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的复 杂的多用途载体应用最为广泛。 • 要有效地利用这些载体，须熟知λ噬菌 体的分子生物学。为了适当地选用这些 载体，还应该了解设计和组建这些载体 时所考虑的原则。
17
（1）λ噬菌体的调节基因： • λ噬菌体的溶原生长和裂解生长发育过 程是在6个调节基因的控制下进行的； 如cI、cro、N、Q、cⅡ/cⅢ • cI：溶原性阻遏蛋白，能抑制除自身 外所有基因的转录。 • cro和N：是两个前早期基因，

载体

载体

乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
P
O
Z
Y
X
诱导物
乳糖
P O
Z
Y
X
Am
lacZ
N2H
COOH
片段
片段
lacZ
标志补救（ß -半乳糖苷酶法）
Lac Z
X-gal
λ噬菌体载体的构建

构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制 位点的删除。 野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种 限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、 NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶 各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切 点在λ增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌 体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载 体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作 为载体的噬菌体λ都短于野生型。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
质粒的类型

F质粒 F因子
能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不 存在该质粒的细胞中

R质粒 抗药性因子
编码一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将这 种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞，使后者也获 得同样的抗菌素抗性能力
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。 可见其原型质粒在使用上有优点。
较小的分子量 两种抗菌素抗性标记 较高的拷贝数 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生
的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分

噬菌粒载体

噬菌粒载体

（2）pUCll8和pUCll9噬菌粒载体的优点 主要的有如下几个方面： （i）具有小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与 操作； （ii）编码有一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带着pUCll8或pUCll9噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞， 才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； （iii）拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的 载体DNA； （iv）存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子 上； （v）由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5′-端编码区，故可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组体分子； （vi）lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便 会以融合蛋白质形式表达，即产生出β 半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物； （vii）含有一个质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方 法，复制形成大量的双链DNA分子； （viii）带有一个M13噬菌体的复制起点，所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并 包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中； （ix）在Puc118和pUCll9这两个载体中，多克隆位点区的核着酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可 转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录负链DNA。 （x）可以直接对克隆的DNA片段进行核着酸序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。
（3）pUCll8和 pUCll9噬菌粒载体的克隆程序 应用PUClls或PUCllg噬菌粒作载体克隆外源DNA的标准程序，包括连接、转化和 筛选三个基本的步骤。首先选用适当的核酸内切限制酶，分别对克隆的外源DNA及载 体分lacZ△15的大肠杆菌之Amps表型菌株，涂布在含有Xgal-IPTG和氨个青霉素的营养培 养基平板上。只有获得了噬菌粒载体的转化子细胞才能生长成菌落，其中多克隆位点 上插入了外源DNA片段的呈白色，反之则呈蓝色。 图5-17展示了通过加 BamHI衔接物的办法，将目的基因克隆到pUCll9噬菌粒载体 的基本过程。

基因克隆的载体噬菌粒载体

基因克隆的载体噬菌粒载体
3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用 少许大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量载体DNA；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第3页
4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第2页
常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
第4页
8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
第6页
pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；

分子生物学载体课件

分子生物学载体课件
• 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异 序列，便于外源基因的整合。
• 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制 子，便于基因能在两种不同的受体细胞中 复制。
• 探 针 质 粒 筛选克隆或寻找基因元件。
23
如何阅读质粒图谱
• 1.首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真 核/穿梭质粒）
• 2.再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 1 Ampr 水解β －内酰胺环，解除氨苄的毒性。 2 Tetr 可以阻止四环素进入细胞。 3 Camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失 去毒性。 4 neor（Kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418 （卡那霉素衍生物）失活 5 Hygr 使潮霉素β 失活。
40
T4 Bacteriophage
41
42
2.2 噬菌体的生活周期（有两种）
1. 溶菌周期 —— 烈性噬菌体（virulent phage) 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重
新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量 子代噬菌体。 2. 溶原周期 —— 温和噬菌体（temperate phage)
• 2.8kb
• 元件来源 ① 复制起点：pBR322的 ori ② Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克 隆位点。
③ lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的α-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多 种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能 灭活下游lacZ基因。
3 温控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
温度低（低于37 ℃），拷贝数很少； 温度增加（>40 ℃）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。

Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体

Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体

4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4

3-基因工程载体的构建

3-基因工程载体的构建

三、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 噬菌体
M13 噬菌体
1. 单链DNA噬菌体的特点 （1）+DNA。（ssDNA） （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。
（4）不存在包装限制。
（5）可产生大量的含有外源DNA插入片 段的单链分子，便于作探针或测序。
pUC118/p pUC18/ UC119 pUC19 pBS pUC
M13
M13 f1
M13变异 XS127， XS101 株 M13K07 MV1184
M13K07 XL1-Blue
辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。
（3）pUC118/pUC119
① 构成
1）M13的基因间隔区（IG） 带有M13复制起点。 2）pUC18/pUC19质粒载体： 质粒复制起点 Ampr lacZ’ MCS
包装
辅助M13
外壳蛋白
③ 噬菌粒载体的包装
1）辅助噬菌体：
如M13K07等。
自身的复制起点发生了突变，复制效率 低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白 和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。 2）包装： 辅助噬菌体 外壳蛋白和 复制蛋白 噬菌体
噬菌粒载体
ssDNA
（4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS） Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。 ① 组成 由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和 T3、T7噬菌体的启动子组成。 ② 特点 1）定向体外转录
M13
（2）噬菌体展示载体的构建
把外源DNA片段插入基因Ⅲ的序列前端， 并保持两者的阅读框正确，表达出融合 蛋白。 启动子 外源DNA M13基因Ⅲ
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第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ蛋白进E.coli细胞内，↓感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。

通过 结构进行几轮复制。

↓当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。

↓E.coli DNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MB DNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3 -CH上合成(+)DNA)。

↓当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。

*1.只形成(+)DNA的原理：当每个感染细胞中合成出200个(+)DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。

这种蛋白质通过同(+)链DNA结合，从而阻断了(-)链DNA的合成。

*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面：①阻断GeneIImRNA的转译；②与新合成的(+)DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。

图M13 phage在感染的E.coli Cell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。

导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RF DNA分子，随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。

因此在感染的细胞内，RF DNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。

D．异常的形态发生(大的克隆能力)与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。

由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。

E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。

每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。

二、M13克隆体系1．M13克隆体系A．M13mp载体系列是Messing et al., 构建的。

这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。

M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。

B．M13克隆体系的寄主菌寄主菌的F'因子含有缺陷型的β-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。

这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的β-半乳糖苷酶N端片段与寄主F'因子产生的缺陷型的β-半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。

*M13噬菌体之寄主菌株应用M13噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：JM101，JM105，JM107，JM109，JM110，TG1，TG2，XL1-Blue，XS127，XS101，71/18，KK2186，MV1184，(FromSomebrook et al., 1989. P.211)2．M13克隆体系β-半乳糖苷酶显色反应原理*M13和相关寄主菌株如JM101。

由于它们单独均不能产生有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。

只有当M13 phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此可以显色。

A．X-gal显色反应原理具功能活性的β-lac是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物X-gal：(X-gal: 吡喃半乳糖苷衍生物)5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切成半乳糖和深蓝色的底物-靛蓝：5-bromo-4-chloroindigo因此，X-gal可以作为检测β-半乳糖苷酶活性的一种有效的指示剂。

B．顺反子内互补作用或α-互补作用推理：*使M13体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的lac操纵子，但这样的结果会使M13分子过大而不便于克隆操作。

*所以，应用DNA重组技术构建出只具β-半乳糖苷酶基因一小部分的M13派生载体。

这个片段编码β-半乳糖苷酶的氨基末端，即α-肽链。

*通过顺反子内互补测验(intracistroniccomplementation test)便可检测出这种α肽链的功能活性。

定义：所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

举例：两个lac操纵子突变体：一个在染色体上Lac-一个在F质粒上Lac-当两者同处一个细胞内(部分二倍体)，两个lac突变体互补了，形成Lac+α互补作用：顺反子互补也可以多肽形式出现，例如M13克隆体系就是一个典型的例子。

Lac缺失突变lacZ(∆M13)简称M15↓合成一种缺失了11-41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶，又称M15多肽。

这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。

遗传标记lacZ∆M15：缺失突变体，缺失lacZ基因中的β-半乳糖苷酶N端部分编码序列。

∆M15所表达的小肽可以参与α互补。

M13 phage的许多寄主菌所携带的F'附加体都有这种缺失的lacZ基因变种。

但是，在体外加入野生型的β-半乳糖苷酶的溴化氰片段(cyanogens bromide fragment)(2-92氨基酸)就可以使M15多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。

因此说溴化氰自然补偿了lacZ基因的M15突变，这种作用叫做α-互补作用：其中M15蛋白质多肽叫α-受体溴化氰片段叫α-给体M13-JM101互补作用：实验发现，用一种特定的β-半乳糖苷酶的HindII片段代替溴化氰片段，同样也可以发生α-互补。

在M13-JM101克隆体系中；M13噬菌体载体具有lac HindII片段，JM101 F质粒具有M15突变基因。

所以M13-JM101是可以实现α-互补作用的；可形成具功能活性的β-半乳糖苷酶。

克隆基因活性的调节：M13载体所携带的HindII片段上具有：lacI'lac启动子(P)lac操纵位点(O)lacZ'(α-肽链)4 个组成部分，简称lacZOPI片段。

*HindII片段=lacZOPI片段*由上述可见M13-HindII片段上不带有功能性的阻遏基因。

所以在被感染的细胞中， -半乳糖苷酶的合成将是组成型的：因为当M13噬菌体颗粒感染了E.coli细胞之后，很快就会累积约200个RF DNA/cell；假若其上带有HindII片段，那么普通的lac+细胞的阻遏状态将会随着HindII片段的复制而得以消除；这是因为每个细胞中都仅存有10个左右的阻遏物分子的缘故。

结果在感染的细胞中，lac结构基因的转录活动便属于组成型的。

*从组成型到诱导型的改造为了克服这种组成性，已将lac阻遏基因的I q突变引入寄主细胞。

这个I q突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的M13 RF DNA分子。

在具有lacI q 突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入一种诱导物，典型的是IPTG，就可以激活HindII片段的复制。

IPTG分子结构式IPTG的作用：*是一种含硫的乳糖类似物。

IPTG：isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷。

*这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。

所以我们称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物(gratuitous inducer)，亦即不发生代谢变化的诱导物。

*在X-gal显色反应中，β-半乳糖苷酶同样也需要诱导，但X-gal 不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入IPTG。

JM101寄主菌株(及其它类似菌株)：在M13克隆体系中常用JM101菌株作寄主，该菌株染色体上的lacZ基因已经缺失了，但在它携带的F质粒上有一个M15基因和lacI q突变，这有两个方面的作用：*第一，可以产生出超量的lac阻遏物，这就使得lac操纵子的表达置于培养基中渗入的IPTG的调控之下。

*第二，当M13载体感染之后，通过α-互补作用，便会形成有功能活性的β-半乳糖苷酶。

在补加X-gal及IPTG的培养基中，就会出现蓝色的菌落。

3．M13载体系列的发展M13噬菌体要发展成克隆载体。