噬菌体载体7页word

第七讲噬菌体载体与柯斯载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月目录一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体2．噬菌体效价测定与双层平板法3．噬菌体的生命周期4．噬菌体的溶源生命周期5．超感染免疫6．溶源性的诱发7．Campbell模型二、λ噬菌体载体1．λ噬菌体的生物学概述2．λ噬菌体载体的构建(1)λ噬菌体载体构建的基本原理(2)插入型载体(3)替换型载体3．λ噬菌体载体的改良(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装(1)λ重组体DNA的转染作用(2)λ噬菌体的体外包装5．λ噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力(3)包装限制的生物学意义6．λ重组体分子的选择方法(1)cI基因功能选择法(2)lacZ基因功能选择法(3)Spi-选择法三、柯斯质粒载体1．柯斯质粒的定义及其构建(1) 噬菌体的克隆能力(2)柯斯质粒载体定义(3)柯斯质粒pHC79的构建(4)柯斯质粒克隆能力及其组成2．柯斯质粒载体的特点3．柯斯质粒载体的改良4．柯斯克隆(1)定义(2)理论依据(3)柯斯质粒包装条件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的优点5．柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3)Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。

作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。

“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。

其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。

本文就λ噬菌体的基因组结构、溶源化状态的建立和基因工程应用做简要的综述，分析存在的问题，并对研究方向进行了展望。

关键词：λ噬菌体溶原性溶菌性基因克隆引言：大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。

基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。

λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。

感染时吸附位点为细胞壁。

属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。

以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。

用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。

1、The discovery of bacteriophage lambda1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一个证明了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K-12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。

从此之后，λ噬菌体被广泛用于模式物种；1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了λDNA整合到细菌DN A的机制；之后由λ噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。

2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、结构特点：λ为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp），因分子两端各有一含12个核苷酸的黏性末端，故又可黏合成环状分子。

第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

第三章噬菌体载体一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。

2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。

3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。

在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。

它有一个复制起点，进行—-------—向复制。

λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。

其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。

这种黏性末端可以自然成环。

成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。

4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。

5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。

6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。

从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。

8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。

9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，(3)———————————。

10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。

λ噬菌体载体λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。

是一种中等大小的温和噬菌体。

迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。

一．λ噬菌体的分子生物学概述（1）λ噬菌体基因组的结构在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。

注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。

随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。

这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。

在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。

（2）λ噬菌体DNA的复制在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。

到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。

（3）λ噬菌体DNA的整合与删除λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。

整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。

的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。

λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。

（4）λ噬菌体DNA的转录与转译在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。

大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体载体第三章噬菌体载体一、填空1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是―-----------―；二是----------――。

2.首次报道的完整测序的单链DNA噬菌体是фX174，含有5386个碱基对的DNA和一个基因，是一个环状DNA分子。

基因组的最大特征是----------------。

3．λ噬菌体的基因组dna为―――――――kb，有――多个基因。

在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按―-----―复制，成熟包装(晚期复制)则是按―--------―复制。

它有一个复制起点，进行―-------―向复制。

λ噬菌体的dna既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。

其原因主要是在λ噬菌体线性dna分子的两端各有一个――个碱基组成的天然黏性末端。

这种黏性末端可以自然成环。

成环后的黏性末端部位就叫做――――――位点。

4.根据噬菌体的包装能力，将噬菌体基因组DNA转化为野生型λ插入载体。

该载体的最小分子量约为――KB，插入的最大外源片段不超过――KB。

5．野生型的m13不适合用作基因工程载体，主要原因是――――和--------------―。

6.Cosmid是一种质粒噬菌体杂合载体。

它的复制子来自---，cos位点序列来自---，最大的克隆片段达到----KB。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。

从酶切点看，插入型为――个，取代型为――个。

8.野生型λ噬菌体DNA不应被用作基因工程载体，原因如下：（1）-----（2）-----（3）------。

9．m13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)――――――――(2)―-------------―，(3)―――――――――――。

10.噬菌体颗粒由质粒和噬菌体DNA组成，其中质粒的主要结构是---------，而噬菌体的主要结构是---------。

11．m13单链噬菌体基因2和基因4之间的ig区有三个最重要的功能，即(1)―――――(2)―------------―(3)―-------------―。

第四节单链丝状噬菌体载体一、M13 噬菌体的生物学1．M13 噬菌体的组成和结构M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。

感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为V00604）。

基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。

较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。

M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。

所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。

基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。

图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。

M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。

噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α 螺旋蛋白。

顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。

5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。

图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。

2．M13 噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。

在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。

随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。

在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA），即 RF DNA 。