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第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体是一种病毒，它感染细菌并利用细菌的机制进行自我复制。
质粒则是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子。
下面是噬菌体和质粒DNA的复制方式。
噬菌体的复制方式：
1. 吸附：噬菌体通过尾部特异性地吸附到宿主细胞的表面。
2. 侵入：噬菌体的尾部通过酶的作用切开宿主细胞的外膜，注入内部的DNA。
3. 复制：噬菌体的DNA进入宿主细胞的核，利用宿主细胞的机制进行DNA复制。
首先，噬菌体的DNA作为模板，利用宿主细胞的酶和能量进行复制，产生新的噬菌体DNA。
然后，这些新的DNA与蛋白质外壳组装，形成新的噬菌体颗粒。
4. 成熟与释放：最后，成熟的噬菌体颗粒通过宿主细胞的裂解被释放出来，进行下一次的感染。
质粒DNA的复制方式：
1. 自我复制：质粒DNA可以在宿主细胞内进行自我复制。
质粒DNA的复制依赖于宿主细胞的机制，包括使用宿主细胞的DNA聚合酶进行复制，以及利用宿主细胞的能量进行ATP合成等。
2. 分配：在宿主细胞分裂时，质粒DNA会被平均分配给两个子细胞。
质粒DNA 的复制和分配是受调控的，以确保其在宿主细胞内的稳定遗传。
无论是噬菌体还是质粒，它们在复制过程中都受到各种因素的调控，以确保其稳定性和适应性。
这些过程涉及许多生物化学反应和结构变化，为深入理解这些过程需要研究更多的科学细节。
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
噬菌体转导的操作方法噬菌体是一种可以侵染并感染细菌的寄生病毒。
也可以通过一定的操作方法进行噬菌体的转导，即将噬菌体导入到目标细菌中。
噬菌体转导的方法有多种，包括传统的混合转染和现代的质粒张量传递等。
下面将详细介绍这些方法以及其他与噬菌体转导相关的操作步骤。
一、传统的混合转染方法1. 实验室条件准备：首先需要在无菌环境下操作，在实验室环境中设置无菌台，准备好所需的培养基、细菌菌种、噬菌体溶液和培养皿等。
2. 培养目标细菌：首先，将目标细菌分别接种到含有适合其生长的培养基中，培养至合适的生长状态。
3. 噬菌体溶液制备：将待转导的噬菌体培养物取出，可以进行多次离心洗涤，以去除一些不必要的物质。
然后将噬菌体溶液稀释合适的倍数，通常以MOI （Multiplicity of Infection）为计量单位，即用噬菌体粒子数和目标细胞数的比值来衡量噬菌体转染的效果。
4. 转染实验操作步骤：将噬菌体溶液与目标细菌培养物混合均匀，使噬菌体感染目标细菌。
通常，将细菌培养物与噬菌体溶液在37下静置一段时间（通常为10-30分钟）或在摇床上轻微摇动，以促进噬菌体与细菌结合。
然后，将混合物转移到预先加热的琼脂糖平板上，并均匀摇晃，使得细菌和噬菌体充分接触。
然后将含有混合物的琼脂糖平板培养在适当的温度下，通常在37下培养一段时间，让噬菌体感染目标细菌并形成溶菌斑。
5. 结果分析：观察琼脂糖平板上是否出现了溶菌斑，即噬菌体感染目标细菌后引起的溶解区域。
溶菌斑的大小和数量可以用来评估噬菌体的转导效果和细菌对噬菌体的感受性。
二、质粒张量传递方法传统的混合转染方法虽然简单易行，但受到不少限制，如只能传递噬菌体基因组，不能有效转导大分子质粒等。
而质粒张量传递方法则可以绕过这些限制，使得噬菌体转导的应用领域更加广泛。
1. 质粒构建：首先，需要构建带有目的基因的质粒，该质粒通常包括适当的启动子、转录起始序列、编码序列和终止序列。
2. 噬菌体构建：然后，将构建好的质粒导入到适当的噬菌体质粒载体中。
λ噬菌体包装质粒原理
噬菌体包装质粒是通过利用噬菌体感染细菌并将质粒DNA包装入噬菌体颗粒中来制备。
其原理包括以下几个步骤：
1. 噬菌体感染：选择一种合适的寄主细菌，使其被特定的噬菌体感染，噬菌体一般是属于细菌的病毒，在细菌被噬菌体感染后，噬菌体将控制细菌的合成机制并复制自身。
2. 质粒DNA插入：将感兴趣的质粒DNA插入到被感染的细菌中，这一步骤一般通过细菌转化技术实现，使质粒DNA进入细菌细胞质。
3. 质粒DNA复制和包装：被插入的质粒DNA在被感染的细菌中进行复制，同时噬菌体的复制机制也被激活。
在病毒复制的过程中，质粒DNA被包装入噬菌体颗粒中，形成带有质粒DNA的新的噬菌体。
4. 细菌溶解和收集：当感染的细菌数量达到一定程度时，噬菌体会释放，溶解宿主细菌。
此时，溶解的细菌中含有大量包装有质粒DNA的噬菌体颗粒，通过离心等方法，可以收集到纯净的噬菌体和质粒DNA。
通过以上步骤，可以利用噬菌体包装质粒原理，制备纯净的质粒DNA。
这种方法在基因工程实验中被广泛应用，包括基因克隆、重组蛋白表达、基因组库构建等。
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
噬菌体载体复习题及答案一、填空题1. 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它 在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；②对某些噬菌 体(如入噬菌体)的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆 宿主系统的遗传研究的比较详尽。
2. 入噬菌体基因组DNA 为48.5 kb,根据入噬菌体的包装能力，其 包装DNA 限度为37〜51 kb,为其本身基因组的75〜105 %。
将野生 型入噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，如X ZAP II,该载体的 最小分子大小约为48.2kb,插入的外源片段最大不超过10. 2kb 。
构 建的入取代型载体XEMBL4,基因组大小为42. 36kb,填充DNA 片段为 14 kb,可容纳的外源DNA 分子最大为23 kb 。
3. 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的 限制性内切核酸酶识别位点和选 择标记。
4. 黏粒(cosmid)是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒,大的克隆片段达到45 kb o 8.野生型的入噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子 质量大；②酶的多切点；③无选择标记。
cmCOS 位点序列来自入噬菌体，9. M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：①SS-RF ；②RF-RF ；③ RF->SSo二、选择题（单选或多选）1.限制性内切核酸酶屁oR I在野生型的入噬菌体DNA中有5个切点，Hind III 有7 个切点，Banil I也有5个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（A ）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切2.pBluescript M13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的？（D ）A. 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析B. 利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增C. 利用通用引物进行序列分析D.利用这两个启动子进行定点突变3. 下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（C ）外都是正确的。
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
