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TAT-EGFP融合蛋白的表达及其在小鼠体内跨膜转导与分布的研究柳雅立;陈德喜;于志勇;张洪海;吴亚松;石英;吴昊【期刊名称】《中华肿瘤防治杂志》【年(卷),期】2008(15)15【摘要】目的:建立TAT-EGFP融合蛋白在原核细胞中表达的试验方法,探讨该融合蛋白经过胎盘屏障后在小鼠体内跨越各种生物膜转导及分布情况。
方法:将重组表达载体pET32-TAT-EGFP转化E.ColiBL21,得到稳定表达的融合蛋白,纯化后注入孕鼠腹腔内,注射后第3天分别取母鼠和仔鼠组织,并做快速冷冻切片,观察融合蛋白在小鼠体内的分布。
结果:成功表达了相对分子质量为32×103的TAT-EGFP融合蛋白。
该融合蛋白能在小鼠不同组织细胞内分布,在小肠上皮分布最为明显,并能透过胎盘及血脑屏障。
结论:TAT介导的EGFP可在小鼠体内广泛跨膜转导分布,为进一步研究其他大分子活性物质进入细胞及其功能奠定了良好基础。
【总页数】3页(P1121-1123)【关键词】基因产物;tat;重组融合蛋白质类;蛋白质转运【作者】柳雅立;陈德喜;于志勇;张洪海;吴亚松;石英;吴昊【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院性病艾滋病实验室;山东省肿瘤医院乳腺科【正文语种】中文【中图分类】R73-37【相关文献】1.跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究 [J], 贾文超;甘鹏;熊亮;潘传英;蓝贤勇;陈宏2.细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导 [J], 董晓;王家宁;唐俊明;潘国栋;黄永章;杨建业;曹书芬3.反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运 [J], 王海珍;许予明;陈奎生;李惠翔;张红新;杨静;张云汉4.TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导[J], 周洲;李永丽;源春彦;曲良建5.TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运 [J], 梁英民;蒋珊珊;孙强;刘利;刘强;陈任安;李巧娥;韩骅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
损伤相关分子模式与组织修复①晏黎饶亚华②黄伟②崔天盆②（湖北中医药大学检验学院，武汉430065）中图分类号R392文献标志码A文章编号1000-484X（2022）07-0872-06［摘要］机体免疫系统通过识别自身组织或细胞释放的危险信号做出免疫应答。
损伤相关分子模式（DAMPs）是受损组织或死亡细胞释放的内源性分子，即危险信号，与模式识别受体（PRRs）结合后，激活免疫应答，诱导炎症反应。
除感染、损伤外，活细胞在伤害应激、代谢失衡等情况下也能主动释放DAMPs。
最近研究发现，DAMPs在急性损伤后的组织修复中发挥重要作用。
本文将对已知DAMPs的分类及其在组织修复中的应用进行简要综述。
［关键词］损伤相关分子模式；组织修复；高迁移率族蛋白B1；三磷酸腺苷；S100s；钙网蛋白Damage associated molecular patterns and it's role in tissue repairYAN Li，RAO Yahua，HUANG Wei,CUI Tianpen.Department of Clinical Laboratory，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan430065，China［Abstract］Immune system responds to the danger signals released by tissues or cells.Damage associated molecular patterns （DAMPs）are endogenous molecules exposedby damaged tissue or dead cells，known as alarmins.After binding to pattern recognitionreceptors（PRRs），activates immune response and induces inflammation.In addition to infection and injury，living cells can also release DAMPs undergoing stress and metabolic imbalance.Recent studies have found that DAMPs play an important role in tissue repair after acute injury.In this paper，the classification of known DAMPs and their application in tissue repair will be briefly reviewed.［Key words］DAMPs；Tissue repair；HMGB1；ATP；S100s；CRT1994年POLLY MATZINGER［1］提出危险理论，认为诱发机体免疫应答的关键因素是自身组织或细胞释放的危险信号。
脑缺血耐受大鼠脑组织血管内皮生长因子和血管生成素-1表达的改变及其意义董滨;孙顺昌;王国峰;刘伯芹;赵玉芳;肖成贤;赵仁亮【摘要】Objective To investigate the changes and their significances of the expression of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and angiopoietin-1 ( Ang-1 ) in brain tissue in rat with brain ischemic tolerance induced by ischemic preconditioning. Methods Ninety-nine Wistar rats were randomly assigned to control group ( n = 9 ) , non IP ( NIP) group ( n = 45 ) and IP group ( n = 45 ) . The IP models were builded by occlusion of middle cerebral artery. Meanwhile, the rats in NIP group were received sham IP. The rats in IP and NIP group at 1, 3, 7, 14, 21 d after IP were ischemiaed again for 2 h and reperfusioned for 22 h. The control group was received sham operation twice. The neurological deficit scores (NDS) was evaluated before the rats scarificed. The cerebral infarct volume was detecd by TTC, and the expression of VEGF and Ang-1 protein in brain tissue were determined by immunohistochemical staining. Results In the control group, there was no infarct lesion in the brain tissue and NDS was 0. NDS and infarct volume in IP 1, 3, 7 d subgroups were significantly less than those in NIP group 1, 3, 7 d subgroups (P<0. 01 -0.05). The lowest NDS and smallest infarct lesion were in IP 3 d subgroup. The expression of VEGF protein in brain tissue in control group was little. The expression of VEGF in IP 1, 3, 7 d subgroups were significantly higher than those in NIP group 1 , 3, 7 d subgroups ( all P < 0. 05 ) , and which in IP 3 d subgroupwas the highest. The expression of Ang-1 protein in brain tissue in each group was observed, but which in IP 7 d subgroup was significantly higher than that in NIP 7 d subgroup ( P < 0. 05 ) . Conclusion After 1 - 7 d of IP, the expression of VEGF and Ang-1 protein in brain tissue are increased and which has very important roles to caused brain ischemic tolerance.%目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)在短暂性脑缺血预处理(IP)诱导的脑缺血耐受大鼠脑组织表达的改变及其意义.方法将99只Wistar大鼠随机分成对照组(9只)、非IP(NIP)组(45只)和IP组(45只).大脑中动脉线栓法建立局灶性IP模型,NIP组以假手术代替预缺血,分别在IP后1、3、7、14、21 d予以缺血2h、再灌注22 h,对照组2次均为假手术.大鼠处死前给予神经功能缺损评分(NDS),采用TTC染色测定脑梗死体积,免疫组化染色法检测脑组织VEGF、Ang-1蛋白表达.结果对照组大鼠脑组织无梗死灶,NDS为0.IP 1、3、7d亚组NDS和梗死体积显著小于NIP组1、3、7d亚组(P＜0.01 ～0.05),其中IP3 d亚组NDS最低,梗死体积最小.对照组脑组织少量VEGF蛋白表达,IP 1、3、7d亚组VEGF蛋白表达显著高于NIP 1、3、7d亚组(均P＜0.05),其中IP3 d亚组VEGF蛋白表达最高.各组脑组织均有一定程度Ang-1蛋白表达,IP7 d亚组Ang-1蛋白表达高于NIP 7 d亚组(P<0.05).结论 IP l～7 d内脑组织VEGF、Ang-1表达增加,对脑缺血耐受的产生具有重要作用.【期刊名称】《临床神经病学杂志》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】4页(P36-39)【关键词】脑缺血耐受;血管内皮生长因子;血管生成素-1;缺血预处理【作者】董滨;孙顺昌;王国峰;刘伯芹;赵玉芳;肖成贤;赵仁亮【作者单位】266002 青岛市第九人民医院神经内科;266002 青岛市第九人民医院神经内科;266002 青岛市第九人民医院神经内科;266002 青岛市第九人民医院神经内科;266002 青岛市第九人民医院神经内科;266002 青岛市第九人民医院神经内科;青岛大学医学院附属医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】R734.31短暂性脑缺血发作是目前公认的缺血性脑血管病的独立危险因素，常预示发生缺血性脑卒中的危险增加［1］。
网络出版时间：２０２４－０３－０９１８：２７：０７ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０３０６．１７２５．０２０藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老周颖东１，张梦娴１，王青玲１，康浩然２，张治成２，王庆林３，刘亚敏４，郭向东２（１．河南中医药大学第一临床医学院，河南郑州 ４５００４６；２．河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科，河南郑州 ４５００００；３．河南医学高等专科学校，河南郑州 ４５１１９１；４．河南中医药大学药学院，河南郑州 ４５００４６）收稿日期：２０２３－１０－１５，修回日期：２０２４－０１－２２基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１４０３４３９）；河南省科技攻关计划（Ｎｏ２２２１０２３１０６０４，２３２１０２３１０４３０）；河南省中医药科学研究专项重点课题（Ｎｏ２０－２１ＺＹ１０４５）；河南省高等学校重点科研项目（Ｎｏ２３Ａ３６００２８）作者简介：周颖东（１９９８－），硕士生，研究方向：内耳疾病，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｙｄ７８６７９４２４２＠１６３．ｃｏｍ；郭向东（１９８０－），硕士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：内耳疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｕｏｘｉａｎｇｄｏｎｇ０６１８＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０９０４３文献标识码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０３－０４５５－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４ １；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３３９ ３８；Ｒ５９１ １；Ｒ７６４ ４３６摘要：目的 探究藁本内酯（ｌｉｇｕｓｔｉｌｉｄｅ，ＬＩＧ）延缓听皮层组织衰老，治疗中枢性老年性聋的机制。
方法 将４０只１３月龄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为ＬＩＧ低剂量组（Ｌ ＬＩＧ）、ＬＩＧ中剂量组（Ｍ ＬＩＧ）、ＬＩＧ高剂量组（Ｈ ＬＩＧ）和衰老组（Ａｇｅ），同品系２月龄小鼠１０只作为对照组（Ｃｔｒｌ）。
小鼠大脑中动脉栓塞模型脑血流量与梗死体积相关性分析谢跃武;张芳;郭岩【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》【年(卷),期】2017(22)5【摘要】目的:探讨线栓法制备小鼠局灶性脑缺血再灌注模型成功的两种评价方法间的相关性,为评价该模型提供一种新的方法和标准。
方法:20只雄性KM小鼠,随机分为模型组(n=10)、假手术组(n=10),采用线栓法阻塞大脑中动脉(MCA)建立局灶性脑缺血再灌注模型,分别于术前、缺血即刻、缺血2 h、再灌注即刻、再灌注24 h利用激光散斑成像技术监测各组小鼠脑血流量变化,再灌注24 h后进行神经功能评分,并行TTC染色法检测脑梗死体积百分比,相关分析判断脑血流量变化与梗死体积百分比之间的相关性。
结果:与假手术组相比,模型组小鼠出现明显的神经功能异常,TTC染色显示出明显的脑梗死,梗死侧脑血流量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
缺血即刻、缺血2 h小鼠脑血流量变化与再灌注24 h脑梗死体积的相关系数R2值分别为0.55、0.28(P<0.05)。
结论:缺血即刻的皮层血流变化与梗死体积具有较好的线性相关。
小鼠脑血流量变化是除神经功能评分和脑梗死体积以外另一种可判断小鼠局灶性脑缺血模型制作成功的可靠且实用的方法。
【总页数】6页(P501-506)【关键词】局灶性脑缺血再灌注模型;神经功能评分;脑梗死体积;脑血流量【作者】谢跃武;张芳;郭岩【作者单位】安徽医科大学药理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R965.2【相关文献】1.电针对大脑中动脉缺血／再灌注模型大鼠脑内5-羟色胺含量及局部脑血流量的影响 [J], 李东湖;李熳2.线栓法大鼠大脑中动脉阻塞脑缺血—再灌注模型行为学特点及其与梗死体积关系分析 [J], 谭杰;李承晏;李涛;周琴;张乾3.小鼠大脑中动脉栓塞脑局部缺血模型及其评价方法 [J], 于培兰;隋雷鸣;韩松;赵焕英;江君;李俊发4.大脑中动脉慢性闭塞患者脑血流动力学参数与脑梗死体积的相关性研究 [J], 韩佳霖; 惠品晶; 颜燕红; 胡春洪; 方琪5.电针人中穴对大脑中动脉梗死大鼠脑皮质局部血流量的影响 [J], 王丽芬; 姚艳玲; 崔景军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
光化学栓塞法建立缺血性脑卒中动物模型马浚宁;高俊玮;侯博儒;任海军;刘吉星;陈四化;严贵忠【摘要】背景:实验性缺血性脑卒中动物模型是研究缺血性脑卒中病理机制以及研究开发新治疗方案必不可少的工具,光化学栓塞法制作缺血性脑卒中动物模型操作简便,稳定性好,重复性高,可有针对性的控制梗死灶的位置以及大小,是研究缺血性脑卒中病理机制的良好选择.目的:建立光化学栓塞法缺血性脑卒中动物模型,对比不同性别小鼠缺血性脑卒中后梗死体积以及行为学表现的异同.方法:62只昆明小鼠依据检测内容分为病理学检测6只、梗死体积测试16只和行为学测试40只.其中病理学检测小鼠分为假手术组和模型组,各3只;梗死体积测试小鼠分为雌性模型组和雄性模型组,各8只;行为学测试小鼠分为雌性模型组、雌性假手术组、雄性模型组和雄性假手术组,各10只.模型组(含雌性模型组和雄性模型组)小鼠采用光化学栓塞法制备局部缺血性卒中模型,假手术组(含雌性假手术组和雄性假手术组)小鼠不注射孟加拉玫瑰红染料.结果与结论:尼氏染色显示模型组小鼠梗死中心出现神经元变性坏死,空泡样病理改变,Fluoro-Jade C染色可见模型组小鼠梗死中心中出现变性神经元,且雌性小鼠脑梗死体积显著小于雄性小鼠,模型组小鼠行为运动功能受损程度显著大于假手术组小鼠,其中雌性小鼠运动功能受损程度小于雄性小鼠.表明光化学栓塞法可以成功建立缺血性脑卒中动物模型,且相同条件下缺血性脑卒中对于雄性造成的神经功能损伤更为严重.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(019)049【总页数】7页(P7951-7957)【关键词】实验动物模型;脑及脊髓损伤动物模型;光化学法;缺血性脑卒中;动物模型;尼氏染色;Fluoro-Jade C染色;行为学;疲劳转棒;前肢抓力;甘肃省自然科学基金【作者】马浚宁;高俊玮;侯博儒;任海军;刘吉星;陈四化;严贵忠【作者单位】兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学生命科学院,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学生命科学院,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学生命科学院,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000;兰州大学第二临床医院神经外科,甘肃省兰州市730000【正文语种】中文【中图分类】R318文章亮点：采用光化学栓塞法建立缺血性脑卒中动物模型，并对比不同性别小鼠缺血性脑卒中后梗死体积以及行为学表现的异同，证实光化学栓塞法可以成功建立缺血性脑卒中动物模型，且相同条件下缺血性脑卒中对于雄性造成的神经功能损伤更为严重。
抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响崔钰莹;邱宇;高洪莲;张磊【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2022(42)6【摘要】目的研究抗血管内皮生长因子(VEGF)融合蛋白康柏西普(Conbercept)玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变(OIR)模型中视网膜多巴胺(DA)含量的影响。
方法普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水(NS)组及OIR+Conbercept组,每组25只。
其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。
OIR组、OIR+NS组及OIR+Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1μL NS、1μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。
取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶(TH)、血管内皮生长因子(VEGF)表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。
结果空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。
与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。
270新医学综述2024年4月第55卷第4期线粒体动力学相关蛋白与缺血性脑卒中研究进展李婷婷 王钦鹏 刘晓庆 蔡珂 魏阳阳 梁成【摘要】缺血性脑卒中是临床常见的急危脑血管病，对人类健康构成了极大的威胁。
近年来，随着对缺血性脑卒中的深入了解，其诊断和治疗取得了显著进展。
然而缺血性脑卒中的病理机制极其复杂，目前的治疗手段也受到部分限制。
研究显示，线粒体功能障碍在缺血性脑卒中的发病机制中起着重要的作用。
通过线粒体动力学调控线粒体功能对于改善脑缺血神经细胞的损伤至关重要。
文章就线粒体动力学的分子机制及对缺血性脑卒中的作用进行综述，以期为缺血性脑卒中的治疗提供有益的参考。
【关键词】缺血缺氧；线粒体动力学；氧化应激；炎症反应；细胞凋亡；坏死性凋亡；铁死亡Research progress in mitochondrial dynamics-related proteins and ischemic stroke Li Tingting△， Wang Qinpeng， Liu Xiaoqing， Cai Ke， Wei Yangyang， Liang Cheng.△The Second Clinical Medical School of Lanzhou University， Lanzhou 730030， China Corresponding author: Liang Cheng， E-mail:*********************【Abstract】Ischemic stroke is a common acute cerebrovascular disease in clinical practice， which poses a severe threat to human health. In recent years， with deepening understanding of ischemic stroke， signi fi cant progress has been made in the diagnosis and treatment. However， current treatments for ischemic stroke are partially limited due to extremely complex pathological mechanisms. Studies have shown that mitochondrial dysfunction plays an important role in the pathogenesis of ischemic stroke. Therefore， modulation of mitochondrial function through mitochondrial dynamics is essential to ameliorate the damage of cerebral ischemic neuronal cells. In this article， the molecular mechanism of mitochondrial dynamics and its role in ischemic stroke were reviewed， aiming to provide useful reference for the treatment of ischemic stroke.【Key words】Ischemia and hypoxia； Mitochondrial dynamics； Oxidative stress； Inflammatory reaction； Apoptosis；Necroptosis； Ferroptosis脑卒中是高患病率、高致残率和高病死率的疾病。
第60卷 第1期2024年02月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .60,N o .1F e b r u a r y2024[收稿日期]2023-06-01; [修订日期]2023-08-21[基金项目]国家重点研发计划项目(2018Y F C 1315200);山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q H 099)[第一作者]满旭(1995-),女,硕士研究生㊂[通信作者]孙锦平(1969-),女,博士,主任医师,博士生导师㊂E -m a i l :s u n j i n p i n g@q d u .e d u .c n ㊂替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用满旭1,韩滨2,汪青青3,孙锦平3(青岛大学,山东青岛 266021 1 医学部中西医结合中心; 2 附属医院神经内科; 3 附属医院急诊内科)[摘要] 目的 探讨替罗非班对急性缺血性卒中(A I S )小鼠脑梗死体积及神经元凋亡的影响㊂方法 将65只雄性C 57B L /6小鼠随机分为假手术组㊁模型组及替罗非班低㊁中㊁高剂量组,每组13只㊂采用光化学脑卒中法建立小鼠脑缺血模型㊂模型组尾静脉注射相同体积的生理盐水,替罗非班各剂量组尾静脉注射不同剂量的替罗非班㊂采用神经行为学评分(m N S S 评分)评估小鼠神经功能缺损,2,3,5氯化三苯基四氮唑(T T C )测定小鼠脑梗死体积,T U N E L 染色与N e u N 染色检测小鼠神经元凋亡情况㊂结果 5组的m N S S 评分㊁脑梗死体积㊁T U N E L 阳性细胞数量和N e u N 阳性细胞数量差异有统计学意义(F =9.630~124.927,P <0.05)㊂与模型组相比,替罗非班中剂量组神经行为损伤明显改善㊁脑梗死体积下降㊁T U N E L 阳性细胞数量减少㊁N e u N 阳性细胞数量增加,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂结论 中剂量替罗非班可降低A I S 小鼠神经功能缺损评分㊁减小脑梗死体积及减轻神经元凋亡,从而发挥神经保护作用㊂[关键词] 替罗非班;缺血性脑卒中;神经行为学表现;脑梗死;神经细胞凋亡抑制蛋白[中图分类号] R 972.7;R 743.3 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2024)01-0017-06d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2024.60.021[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20240319.1459.004;2024-03-21 17:37:49N e u r o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f t i r o f i b a n i nm i c ew i t ha c u t e i s c h e m i c s t r o k e MA N X u ,HA N B i n ,WA N G Q i n g q i n g ,S U N J i n p i n g (C e n t e r f o r I n t e g r a t e dT r a d i t i o n a l C h i n e s e a n dW e s t e r nM e d i c i n e ,D e p a r t m e n t o fM e d i c i n e ,Q i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266021,C h i n a)[A b s t r a c t ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h eef f e c t so f t i r o f i b a no nb r a i n i n f a r c tv o l u m ea n dn e u r o n a l a p o p t o s i s i n m i c ew i t h a c u t e i s c h e m i c s t r o k e (A I S ). M e t h o d s S i x t y -f i v e C 57B L /6m i c ew e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t os h a mg r o u p ,m o d e l g r o u p,a n d l o w -d o s e ,m e d i u m -d o s e ,a n dh i g h -d o s e t i r o f i b a n g r o u p s ,w i t h13m i c e i ne a c h g r o u p .A m o u s em o d e l o f c e r e b r a l i s c h e m i aw a s e s -t a b l i s h e d t h r o u g h p h o t o c h e m i c a l t h r o m b o s i s .T h em o d e l g r o u p r e c e i v e d i n j e c t i o no f t h e s a m ev o l u m eo f n o r m a l s a l i n ev i a t h e t a i l v e i n ,w h i l e t h e t i r o f i b a n g r o u p s r e c e i v e d i n j e c t i o no f d i f f e r e n t d o s e so f t i r o f i b a n i n t o t h e t a i l v e i n .T h en e u r o l o g i c a l d e f i c i t so fm i c e w e r e e v a l u a t e du s i n g t h em o d i f i e dn e u r o l o g i c a l s e v e r i t y s c a l e (m N S S ).T h e b r a i n i n f a r c t v o l u m ew a sm e a s u r e d w i t h2,3,5-t r i p h e -n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e s t a i n i n g .N e u r o n a l a p o p t o s i sw a s d e t e r m i n e dw i t hT U N E Ls t a i n i n g a n dN e u Ns t a i n i n g . R e s u l t s T h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h em N S S s c o r e ,c e r e b r a l i n f a r c t i o nv o l u m e ,t h e n u m b e r o fT U N E L -po s i t i v e c e l l s ,a n d t h e n u m b e r o fN e u N -p o s i t i v e c e l l s b e t w e e n t h e f i v e g r o u p s (F =9.630-124.927,P <0.05).C o m p a r e dw i t h t h em o d e l g r o u p,t h em e d i u m -d o s e t i r o f i b a n g r o u p s h o w e d s i g n i f i c a n t l y r e s o l v e dn e u r o b e h a v i o r a l d a m a g e ,a s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d c e r e b r a l i n f a r c t i o nv o l u m e ,a s i gn i -f i c a n t l y d e c r e a s e d n u m b e r o f T U N E L -p o s i t i v e c e l l s ,a n d a s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d n u m b e r o fN e u N -po s i t i v e c e l l s (P <0.05). C o n -c l u s i o n A m e d i u md o s e o f t i r o f i b a n c a n p l a y a n e u r o p r o t e c t i v e r o l e i nm i c ew i t hA I S ,d e c r e a s i n g n e u r o l o g i c a l d e f i c i t s c o r e ,i n f a r c t v o l u m e ,a n dn e u r o n a l a p o pt o s i s .[K e y wo r d s ] t i r o f i b a n ;i s c h e m i c s t r o k e ;n e u r o b e h a v i o r a lm a n i f e s t a t i o n s ;b r a i n i n f a r c t i o n ;n e u r o n a l a p o p t o s i s -i n h i b i t o r y p r o -t e i n急性缺血性卒中(A I S )病人约占所有卒中的80%[1]㊂A I S 的病理过程涉及炎症㊁细胞凋亡和神经元损伤[2]㊂对于A I S 病人,在发病后4.5h 内,静脉溶栓是标准治疗方法[3],可改善临床预后并降低死亡率[4]㊂目前针对A I S 的治疗方法十分有限,迫切需要开发新疗法㊂A I S 治疗的主要目标是保护正常脑组织,促进梗死区附近缺血半暗带区域的功能恢复[5]㊂有研究表明,抗血小板药物的使用对于A I S 治疗是必要的[6-7]㊂替罗非班是一种半衰期短的速效糖蛋白(G P )Ⅱb /Ⅲa 抑制剂,可通过可逆阻断纤维蛋白结合受体来抑制血小板聚集的最终共同途径[8]㊂替罗非班在未接受早期再通治疗的A I S病人中是安全有效的[9]㊂本研究探讨不同剂量替罗18青岛大学学报(医学版)60卷非班对小鼠脑梗死体积以及缺血半暗带区神经元凋亡的影响,为替罗非班用于A I S病人提供依据㊂现报告如下㊂1材料与方法1.1实验材料雄性C57B L/6小鼠65只,体质量为(26ʃ2)g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供㊂2,3, 5氯化三苯基四氮唑(T T C)购自美国S i g m a公司㊂T U N E L细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司㊂N e u N抗体购自英国A b c a m公司㊂驴抗兔I g G二抗购自美国T h e r m oS c i e n t i f i c公司㊂40g/L多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司㊂盐酸替罗非班氯化钠注射液由鲁南贝特制药有限公司提供㊂制备光化学模型所需光纤冷光源仪器购自德国S c h o t t公司㊂冷冻超薄切片机购自德国L e i c a 公司㊂荧光显微镜购自日本O l y m p u s公司㊂1.2实验方法1.2.1光化学卒中模型制备及实验分组采用光化学方法诱导血栓形成脑缺血模型[10]㊂将所有小鼠随机分为假手术组㊁模型组㊁替罗非班低剂量组(2.5m g/k g)㊁替罗非班中剂量组(7.5m g/k g)和替罗非班高剂量组(12.5m g/k g),每组13只㊂光化学卒中模型建立后,假手术组注射孟加拉玫瑰红后不光照,其余手术步骤同模型组㊂模型组小鼠尾静脉注射相应体积的生理盐水,其余各组小鼠分别尾静脉注射低㊁中㊁高剂量替罗非班㊂24h后,每组随机选取10只小鼠进行神经行为学评分(m N S S评分),之后处死小鼠,测量脑梗死体积㊂随后,每组取剩余的3只小鼠进行冷冻切片标本采集,进行免疫荧光实验㊂1.2.2 m N S S评分 m N S S评分范围为0~18分,内容主要包括运动测试㊁感觉测试㊁平衡木测试和反射测试[10]㊂m N S S评分越高,表示神经系统损伤越严重㊂1.2.3脑梗死体积的测定在光化学所致的脑缺血模型形成后24h后采用T T C染色法对小鼠脑组织进行染色㊂白色区域的体积即为脑梗死体积㊂具体步骤如下:腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠,去除小鼠颅骨后,取出脑组织放置在载玻片上,之后迅速置于-20ħ冰箱中速冻10m i n㊂将冷冻过的脑组织取出,沿冠状面切成约2mm厚的脑片㊂将切片置于20g/LT T C溶液中,37ħ下避光孵育30m i n㊂切片每5m i n翻转一次,最后将染色完成后的脑片放置在40g/L多聚甲醛中固定1h,将固定好的脑片旁边放置直尺,并进行拍照㊂利用I m a g e-P r o-P l u s 软件对梗死区域进行体积的测量,计算脑梗死体积比例㊂脑梗死体积比例=(总梗死体积/各脑切片体积之和)ˑ100%㊂1.2.4 T U N E L法检测小鼠脑缺血半暗带区凋亡细胞数光化学致脑缺血模型建立成功后24h,麻醉小鼠后分离脑组织,脑组织在40g/L多聚甲醛中固定24h,将脑组织转移到含有150g/L蔗糖水的离心管中进行脱水,待脑组织沉入到离心管管底后,将脑组织转移到含有300g/L蔗糖水的离心管中进行进一步脱水,直至脑组织沉入管底,进行下一步包埋㊂脱水后的脑组织嵌入O C T包埋,干冰快速冷冻后,使用温度为-20ħ的冷冻切片机将脑组织沿冠状面切成厚度为8μm的脑片,之后用40g/L多聚甲醛固定脑片30m i n,磷酸缓冲盐溶液(P B S)洗涤2次,每次10m i n㊂加入含体积分数0.005聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o nX-100)的P B S,待破膜完毕后,将脑片用P B S清洗3次㊂使用T U N E L检测试剂盒进行T U N E L测定㊂加入50μLT U N E L反应混合物(5μLT d T酶溶液和45μL标记溶液),并将所得混合物在黑暗潮湿的环境中在37ħ下孵育1h㊂用P B S洗涤3次㊂最后,细胞核使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(D A P I)染色㊂用荧光显微镜观察呈现绿色的凋亡细胞㊂1.2.5免疫荧光染色方法检测小鼠脑缺血半暗带区N e u N的表达将-20ħ冰箱中的脑冷冻切片复温至室温,多聚甲醛固定10m i n,磷酸盐吐温缓冲液洗3次,每次5m i n㊂之后利用体积分数0.003 T r i t o nX-100室温通透10m i n,破膜完毕后,将脑片清洗3次㊂用P B S配制30g/L的牛血清清蛋白进行室温封闭1h㊂封闭完成后,加入N e u N一抗(1ʒ500),并置于4ħ的冰箱中孵育过夜㊂一抗孵育完毕之后,用P B S清洗3次,每次5m i n㊂加入荧光二抗(1ʒ500)后室温避光孵育40m i n㊂二抗孵育完成后,加入D A P I染色,抽选3个荧光显微镜下的视野进行图像分析并计算N e u N阳性细胞数㊂1.3统计学处理应用G r a p hP a dP r i s m9.0软件进行统计学分析㊂计量资料以 xʃs表示,多组数据组间均数的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用B o n-f e r r o n i检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂1期满旭,等.替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用192结果2.1各组小鼠m N S S评分比较m N S S评分结果显示,5组小鼠m N S S评分差异有统计学意义(F=97.234,P<0.05)㊂与假手术组相比,模型组小鼠出现神经功能损伤(P<0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组小鼠神经行为功能损伤减轻(P<0.05)㊂见表1㊂2.2各组小鼠脑梗死体积比较T T C染色结果显示,5组小鼠脑梗死体积差异有统计学意义(F=43.080,P<0.01),与模型组相比,替罗非班中剂量组小鼠脑梗死体积减小(P< 0.05)㊂见图1和表1㊂2.3各组小鼠缺血半暗带区T U N E L阳性细胞数比较凋亡染色结果显示,5组小鼠缺血半暗带区的T U N E L阳性细胞数差异具有统计学意义(F= 124.927,P<0.05)㊂与假手术组相比较,模型组小鼠缺血半暗带区的T U N E L阳性细胞数上升(P< 0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组的T U N E L 阳性细胞数减少(P<0.05)㊂见图2和表1㊂2.4各组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数的比较免疫荧光结果显示,5组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数差异有统计学意义(F=9.630, P<0.05)㊂与假手术组相比,模型组㊁低剂量替罗非班组小鼠缺血半暗带区N e u N阳性细胞数显著下降(P<0.05);与模型组相比,替罗非班中剂量组的N e u N阳性细胞数显著上升(P<0.05)㊂见图3和表1㊂表1各组小鼠m N S S评分㊁脑梗死体积比例㊁T U N E L 阳性细胞数和N e u N阳性细胞数的比较( xʃs)组别m N S S评分(分)脑梗死体积比例(χ/%)T U N E L阳性细胞数N e u N阳性细胞数假手术组00098.0ʃ4.0模型组10.00ʃ1.53*21.33ʃ1.51*141.0ʃ11.5*70.0ʃ6.2*低剂量组 9.23ʃ1.17*20.55ʃ2.01*132.3ʃ7.5*76.3ʃ7.4*中剂量组7.92ʃ1.75*# 13.04ʃ1.92*# 110.3ʃ11.5*#90.0ʃ7.0#高剂量组 8.92ʃ1.66*19.98ʃ1.90*125.3ʃ7.6*84.0ʃ5.6注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05㊂m N S S评分各组例数为13,脑梗死体积比例各组例数为10,T U N E L 阳性细胞数和N e u N阳性细胞数各组例数均为3㊂3讨论本研究结果显示,替罗非班可减少脑梗死体积和神经元凋亡,改善A I S小鼠神经功能缺损㊂表明替罗非班可以保护A I S后带来的神经损伤,为替罗非班在A I S中的作用提供了新的见解㊂替罗非班是一种高度特异性的非肽类血小板图1替罗非班对A I S小鼠脑梗死体积的作用20青岛大学学报(医学版)60卷放大400倍,标尺=100μm㊂图2各组小鼠缺血半暗带区T U N E L染色G PⅡb/Ⅲa受体拮抗剂,可有效阻断血小板活化和聚集的共同途径[11]㊂在脑卒中相关治疗中,给予G PⅡb/Ⅲa抑制剂可能是安全的,但是应该注意药物种类和剂量[12-13]㊂阿昔单抗可以增加症状性颅内出血的风险,替罗非班在低剂量下可以被认为是安全的[14]㊂与常见的双重抗血小板治疗相比较,替罗非班单药治疗A I S是安全的[15],替罗非班治疗作为未接受再通治疗的A I S病人的补救治疗,是安全有效的[16-17]㊂替罗非班可能是A I S治疗潜在的安全选择[18]㊂有研究表明,替罗非班在大脑中动脉阻塞24h 后可以减小小鼠脑梗死体积,但对小鼠神经功能障碍无明显影响[19]㊂而本研究结果显示,7.5m g/k g 的替罗非班不仅可减小小鼠脑梗死体积,也降低了小鼠神经功能障碍㊂脑卒中发生后,主要引起神经细胞凋亡及机体炎症反应㊂N e u N被认为是一种成熟神经元标志物,是脑卒中研究中极其重要的一个指标[20]㊂本研究结果显示,替罗非班中剂量组小鼠N e u N阳性细胞数明显上升㊂表明替罗非班通过降低梗死体积㊁减轻神经功能损伤以及减少缺血半暗带区N e u N阳性神经元的丢失,在A I S中发挥神经保护作用[21]㊂本研究还发现,较高剂量(12.5m g/k g)替罗非班可能导致更大的脑梗死体积㊂有学者提出了双相剂量反应和激效的概念,即在低剂量刺激下具有有益作用,高剂量会导致抑制甚至毒性效应[22-23]㊂推测高剂量下脑梗死体积的增加可能与双相剂量反应和激效有关㊂综上所述,本研究在动物水平观察了不同剂量替罗非班对A I S小鼠的神经保护作用㊂替罗非班1期满旭,等.替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用21放大400倍,标尺=100μm ㊂图3 各组小鼠缺血半暗带区N e u N 染色可通过减少脑梗死体积以及减轻缺血半暗带区神经元凋亡来发挥神经保护作用㊂本研究未能进一步检测凋亡相关蛋白的变化趋势,也未涉及替罗非班发挥神经保护作用的具体的分子机制及相关通路㊂这些内容我们将在后续研究中进行进一步的探讨㊂[参考文献][1]WA N G W Z ,J I A N G B ,S U N H X ,e t a l .P r e v a l e n c e ,i n c i -d e n c e ,a n dm o r t a l i t y o f s t r o k e i nC h i n a :r e s u l t s f r o ma n a t i o n -w i d e p o p u l a t i o n -b a s e ds u r v e y of480687a d u l t s [J ].C i r c u l a -t i o n ,2017,135(8):759-771.[2]D U A NJL ,C U I J ,Y A N GZF ,e t a l .N e u r o pr o t e c t i v e e f f e c t o fA p e l i n 13o n i s c h e m i c s t r o k e b y a c t i v a t i n g AM P K /G S K -3β/N r f 2s i g n a l i n g [J ].J o u r n a lo f N e u r o i n f l a mm a t i o n ,2019,16(1):24.[3]P OW E R S W J ,R A B I N S T E I N A A ,A C K E R S O N T ,e ta l .G u i d e l i n e s f o r t h e e a r l y m a n a g e m e n t o f p a t i e n t sw i t ha c u t e i s -c h e m i c s t r o k e :3019u p d a t e t o t h e 2018g u i d e l i n e s f o r t h e e a r l y m a n a ge m e n tof a c u t e i s c h e m i c s t r o k e :ag u i d e l i n e f o rh e a l t h -c a r e p r o f e s si o n a l s f r o m t h e A m e r i c a n H e a r t A s s o c i a t i o n /A m e r i c a nS t r o k eA s s o c i a t i o n [J ].S t r o k e ,2019,50(12):e 344-e 418.[4]WA R D L AWJM ,MU R R A Y V ,B E R G EE ,e t a l .T h r o m b o -l ys i s f o r a c u t e i s c h a e m i c s t r o k e [J ].T h eC o c h r a n eD a t a b a s eo f S ys t e m a t i cR e v i e w s ,2014,2014(7):C D 000213.[5]L E I G H R ,K N U T S S O N L ,Z HO U JY ,e ta l .I m a g i n g th e p h y s i o l o gi c a l e v o l u t i o no f t h e i s c h e m i c p e n u m b r a i na c u t e i s -c h e m i c s t r o k e [J ].J o u r n a l o f C e r e b r a l B l o o dF l o wa n dM e t a b o -l i s m :O f f i c i a l J o u r n a l o f t h e I n t e r n a t i o n a lS o c i e t y o fC e r e b r a l B l o o dF l o wa n d M e t a b o l i s m ,2018,38(9):1500-1516.[6]H O U X W ,C H E N HS .P r o p o s e d a n t i t h r o m b o t i c s t r a t e g yf o r a c u t e i s c h e m i cs t r o k ew i t hl a rg e -a r t e r y a th e r o s c l e r o si s :f o c u s o n p a t i e n t sw i t hh i g h -r i s kt r a n s i e n t i s c h e m i ca t t a c ka n d m i l d -22青岛大学学报(医学版)60卷t o-m o d e r a t es t r o k e[J].A n n a l so f T r a n s l a t i o n a l M e d i c i n e, 2020,8(1):16.[7]P H I P P S M S,C R O N I N C A.M a n a g e m e n to f a c u t e i s c h e m i cs t r o k e[J].B M J,2020,368:16983.[8]K I N GS,S H O R T M,H A R MO NC.G l y c o p r o t e i nⅡb/Ⅲa i n-h i b i t o r s:t h e r e s u r g e n c e o f t i r o f i b a n[J].V a s c u l a r P h a r m a c o l o-g y,2016,78:10-16.[9]H A NB,MA T,L I UZD,e t a l.E f f i c a c y a n d s a f e t y o f t i r o f i-b a n i nc l i n i c a l p a t i e n t sw i t h a c u t e i s c h e m i c s t r o k e[J].F r o n t i e r si nN e u r o l o g y,2021,12:785836.[10]C H E NJ,S A N B E R GPR,L IY,e t a l.I n t r a v e n o u s a d m i n i s-t r a t i o no f h u m a nu m b i l i c a l c o r db l o o dr e d u 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