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无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用赵悦;朱巍巍;刘锦燕;孟玲宁;王珏婷;李文静;项明洁【摘要】目的建立无绿藻(Prototheca) PCR ITS1-ITS2基因鉴定分型方法,并通过系统发育树以研究各型别无绿藻菌株间的亲缘关系.方法抽提5株无绿藻临床分离菌株的DNA,通过特异性引物扩增ITS1及ITS2区后,根据该区域核苷酸片段的差异进行基因分型,借助MEGA6.0软件建立系统发育树,并通过SSU rDNA测序加以验证.结果 5株菌株中,1株鉴定为P.zopfii hydrocarbonea,2株鉴定为P.wickerhamii.虽然由于数据库中缺乏P.zopfii portoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定,但ITS区系统发育树中这两株菌仍被归为P.zopfii中独立的一簇,与SSU rDNA系统发育树相近,证明此分型方法无误.结论 PCR ITS1-ITS2基因分型法可作为一种有效基因分型方法用于鉴定和监测无绿藻感染.%Objective To establish the Prototheca PCR ITS1-ITS2 genotyping method,and to generate the phylogenetic tree to study the relationship between different types of Prototheca strains.Methods The extracted DNAs of 5 clinical Prototheca isolates were used to amplify ITS1 and ITS2 region through specific primers.Then,the phylogenetic tree was established with MEGA 6.0 software and verified by SSU rDNA sequencing.Results Among the 5 strains,1 strain was identified as P.zopfii hydrocarbonea,2 strains were P.wickerhamii.Although the rest two strains couldn't be identified due to the lack of ITS sequences of P.zopfii portoricensis,they were still classified as P.zopfii and in an independent cluster which was different from P.zopfii hydrocarbonea.This result was verified by SSU rDNAsequencing.Conclusions The method of PCR ITS1-ITS2 genotyping can beused as an effective genotyping method for identification and surveillance of Prototheca infection.【期刊名称】《中国真菌学杂志》【年(卷),期】2018(013)001【总页数】4页(P4-7)【关键词】无绿藻;无绿藻病;基因型;鉴定;ITS区【作者】赵悦;朱巍巍;刘锦燕;孟玲宁;王珏婷;李文静;项明洁【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020【正文语种】中文【中图分类】R379.9无绿藻 (Prototheca)作为一种3～30 μm的单细胞条件致病菌，通常情况下，定植于人体的指甲、皮肤、呼吸道和消化系统[1]。
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。
丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。
随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。
本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。
1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。
阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。
1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。
1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。
具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。
②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。
③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。
1.4 真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。
PCR反应总体积50μl，10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA 模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。
菌株 its 序列
菌株ITS序列是指真菌的内转录间隔区域（ITS），是真菌分类和鉴定中常用的分子标记。
ITS序列包含了ITS1、5.8S rRNA和ITS2三个区域，其中ITS1和ITS2是高变异的区域，5.8S rRNA是高保守的区域。
ITS序列具有高度的物种特异性和遗传多样性，因此被广泛应用于真菌分类、鉴定、系统发育和生态学研究等领域。
ITS序列的获取通常采用PCR扩增和测序技术。
首先需要设计引物，
通常选择ITS1和ITS4引物对ITS序列进行扩增。
扩增后的产物可以
通过电泳分离和纯化后进行测序。
目前，ITS序列已经成为真菌分类和鉴定的标准分子标记之一，被广泛应用于真菌分类和鉴定。
ITS序列的应用不仅限于真菌分类和鉴定，还可以用于真菌的系统发育和生态学研究。
通过ITS序列的比较和分析，可以揭示真菌的进化关
系和物种多样性。
同时，ITS序列还可以用于真菌的生态学研究，如真菌的种群结构、分布和生态位等方面的研究。
在ITS序列的应用中，菌株的选择和管理非常重要。
菌株的选择应该
考虑到其来源、保存方式和纯度等因素。
菌株的管理应该严格按照规
定的方法进行，以保证ITS序列的准确性和可靠性。
总之，ITS序列是真菌分类和鉴定中常用的分子标记，具有高度的物种特异性和遗传多样性。
ITS序列的应用不仅限于真菌分类和鉴定，还可以用于真菌的系统发育和生态学研究。
在ITS序列的应用中，菌株的选择和管理非常重要，应该严格按照规定的方法进行。
中国兽医寄生虫病 2008,16(4):41 47 Ch i nes e J ournal of Veteri nary Paras it ology收稿日期:2008 01 29基金项目:国家自然资源平台项目(2005DKA 21100);国家自然科学基金项目(30571397);国家高技术研究发展计划(863)项目(2006AA 10A 207);科技部欧盟项目专项经费;中国农业科学院杰出人才基金、欧盟EP IZONE 、ICTTD3(I NCO N o ,510561);SS A I N COM E 项目作者简介:牛庆丽(1981~),女,河南人,研究生,基础兽医学专业。
通讯作者:殷 宏,E ma i:l tt bdcn @pub lic .lz .gs .cn文献综述转录间隔区(I TS)在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展牛庆丽, 罗建勋, 殷 宏(中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046)摘 要:在寄生虫分子分类学研究中,利用核糖体DNA 对寄生虫进行分类学,以及虫种进化关系学的研究,已经成为国际上普遍应用的方法。
但由于它具有高度保守性的特点,所以很难在同种异株的区分上有所作为。
内转录间隔区ITS 是位于寄生虫的遗传物质特别是核糖体DNA (r DNA )上18S 和28S 基因之间的区域片段,由于它在生物种和亚种间变异较大,从而可以用来进行动物原虫种间以及株间的分类鉴定。
因此,在分子分类学领域,越来越多的采用核rDNA 的内转录间隔区(I TS)作为分子标记。
本文介绍ITS 作为分子标记在寄生虫分子分类中的作用及其进展。
关键词: rDNA I T S ;寄生虫;分子标记;应用中图分类号:S852.7 Q 523 文献标识码:A 文章编号:1005 0868(2008)04 0041 07ADVANCES AND APPL ICAT I ON OF RDNA ITS I N THEMOLECULAR TAXONO MY OF PARASI TEN I U Q ing l,i LUO Jian xun , Y I N H ong(S t ate K ey Laboratory of Veter i nary E tiolog ical B iology /K ey Laboratory of A ni m alP arasit o logy of Gansu Pror i nce ,L anzhou Veter i nary R esearch Institute ,CAAS,Lanzhou 730046,Chi na)Abstract :It is a genera lm ethod t h at usi n g riboso m e RNA gene to i d entify the parasites and study the spec i e s evo l u tion re lati o n in mo lecular taxono m y ,H o w ever ,r RNA is very conservati v e there is little change a m ong stra i nw it h i n one species ,so it is very d ifficu lt to i d entify d ifferent stra i n s o f ho m ogene ity .I T S r DNA,l o cati n g bet w een 18S and 28S,has ver y h i g h var i a ti o n i n bio l o g ica l species ,w as and can be used to d istingu ish of an i m a l pr o tozoon species .Recen tl y ,m any papers on m olecular taxono m y o f parasitesw ere pub lished usi n g I T S as a m olecule m ar k er .The paper descri b ed t h e r o le and prog ressi o n of t h e I T S as a m o lecu le m ark i n parasite m o lecu le classification . K ey w ords : r RNA I TS ;parasite ;m olecule m arker ;app licati o n 20世纪80年代以来,分子生物学技术在各个研究领域得到了广泛应用,分子生物学分类也成为寄生虫分类学研究的新途径。
真菌its鉴定真菌（Fungi）是一类特殊的生物，可以在各种环境中生存并繁殖。
它们通常以分解有机物质为生，有着重要的生态作用。
在鉴定真菌时，我们可以使用ITS（Internal Transcribed Spacer）序列来进行分析和判断。
ITS序列位于真菌的核糖体RNA基因间区域，是真菌基因组中高度变异的部分。
通过对ITS序列的测定和比对，我们可以确定真菌的物种归属和亲缘关系。
ITS序列的鉴定已经成为现代真菌分类学的重要手段之一。
ITS序列的鉴定过程通常包括以下几个步骤：第一步是样品的采集和处理。
我们可以从土壤、水体、植物组织、动物体表等不同的环境中采集样品。
采集后，我们需要将样品进行处理，提取其中的真菌DNA。
第二步是PCR扩增。
在这一步中，我们使用特定的引物对样品中的ITS序列进行扩增。
PCR扩增是一种将目标DNA序列扩大数百倍的技术，可以提高后续的测序效果。
第三步是测序和比对。
在这一步中，我们使用测序仪对PCR扩增得到的产物进行测序。
测序结果将是一系列的碱基序列，我们可以将这些序列与已知的ITS序列数据库进行比对，以确定真菌的物种归属。
第四步是数据分析和解读。
在这一步中，我们将根据比对结果来判断真菌的物种归属和亲缘关系。
通常情况下，我们会将测序结果与数据库中的参考序列进行比对，并计算相似性和进化距离等指标来评估真菌的分类位置。
通过ITS序列的鉴定，我们可以辨别出不同物种的真菌，了解其在生态系统中的分布和功能。
这对于研究真菌的多样性、生态学和进化等方面具有重要意义。
除了ITS序列，还有其他一些DNA标记物可以用于真菌的鉴定，如18S rRNA、28S rRNA等。
不同的标记物具有不同的特点和应用领域，在具体的研究中可以根据需要选择合适的标记物进行分析。
总结起来，真菌的ITS序列鉴定是一种常用且有效的方法，可以帮助我们准确地鉴定真菌的物种归属和亲缘关系。
随着测序技术的不断发展和数据库的不断完善，我们对真菌的了解也将越来越深入。
白色念珠菌的几种快速鉴定方法白色念珠菌是一种常见的真菌，它可以引起多种疾病，包括皮肤感染、肺部感染和血液感染等。
因此，快速鉴定白色念珠菌对于临床诊断和治疗非常重要。
以下是几种快速鉴定白色念珠菌的方法。
1. MALDI-TOF质谱法MALDI-TOF质谱法是一种快速、准确的微生物鉴定方法。
它可以通过分析微生物的蛋白质质谱图谱来确定微生物的种类。
对于白色念珠菌的鉴定，MALDI-TOF质谱法可以在几分钟内完成，准确率高达99%以上。
因此，它已经成为临床常用的白色念珠菌鉴定方法之一。
2. PCR扩增法PCR扩增法是一种基于DNA序列的鉴定方法。
它可以通过扩增微生物的DNA片段来确定微生物的种类。
对于白色念珠菌的鉴定，PCR扩增法可以在几小时内完成，准确率高达95%以上。
因此，它也是临床常用的白色念珠菌鉴定方法之一。
3. 细胞培养法细胞培养法是一种传统的微生物鉴定方法。
它可以通过将微生物培养在适当的培养基上来确定微生物的种类。
对于白色念珠菌的鉴定，细胞培养法可以在几天到几周的时间内完成，准确率高达90%以上。
虽然它的速度比较慢，但它仍然是临床常用的白色念珠菌鉴定方法之一。
4. 免疫学方法免疫学方法是一种基于抗体或抗原的鉴定方法。
它可以通过检测微生物的特定抗体或抗原来确定微生物的种类。
对于白色念珠菌的鉴定，免疫学方法可以在几小时到几天的时间内完成，准确率高达90%以上。
因此，它也是临床常用的白色念珠菌鉴定方法之一。
综上所述，以上几种方法都是快速鉴定白色念珠菌的有效方法。
在临床实践中，医生可以根据具体情况选择合适的方法进行鉴定。
同时，为了提高鉴定的准确率，医生还应该结合临床症状、病史和其他检查结果进行综合分析。
菌株its序列简介菌株its序列是一种用于分析真菌的种属和物种鉴定的标志性分子位点。
在分类学和生态学研究中，通过检测和比较菌株中的its序列差异，可以对真菌的分类、进化和多样性进行深入的研究。
its序列的定义菌株its序列即真菌内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，位于真核生物的rDNA中，包括ITS1、5.8S rRNA和ITS2三个区域。
其中，ITS1和ITS2是高变区，可以用于研究种属和物种间的变异。
ITS序列在物种鉴定中的应用ITS序列由于其具有高变性和物种特异性的特点，在真菌物种鉴定中得到广泛应用。
通过与数据库中已知的ITS序列比对，可以准确地将不同的菌株归类到其相应的物种或属级分类。
基于ITS序列的物种鉴定方法，可以实现快速、准确和高通量的真菌鉴定。
ITS序列的分析方法收集菌株样本在进行ITS序列分析之前，首先需要收集菌株样本。
可以选择不同环境中的真菌，如土壤、水体、植物等，或者从已知物种中选取不同的菌株进行分析。
提取菌株DNA从收集的菌株中提取总DNA，可以利用商用的DNA提取试剂盒进行提取。
保证提取的DNA质量和浓度足够用于后续的PCR扩增反应。
PCR扩增ITS序列利用特异性引物对ITS序列进行PCR扩增。
常用的引物对包括ITS1和ITS4。
在扩增过程中，需要根据反应条件进行优化，如温度、循环数等。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
分离和纯化PCR产物对PCR扩增得到的产物进行分离和纯化。
可以使用商用的PCR产物纯化试剂盒，或者通过凝胶切割和DNA回收的方法进行纯化。
测序和序列比对将纯化的PCR产物进行测序，可以选择传统的Sanger测序方法，也可以选择高通量测序技术。
得到测序结果后，进行序列比对，可以使用BLAST等序列比对软件进行比对和比对结果的分析。
物种鉴定和系统发育分析根据ITS序列比对结果，可以进行物种鉴定和系统发育分析。
白色念珠菌核酸检测试剂指导原则白色念珠菌（Candida albicans）是一种常见的真菌，在人体内常常存在。
然而，当人体的免疫系统受到削弱或存在其他风险因素时，这种真菌可能会引发感染。
有时，判断感染是否存在以及确定最佳的治疗方案可以变得非常困难。
幸运的是，现在有一种称为白色念珠菌核酸检测试剂的新型技术可以为医生提供更准确的诊断和治疗指导。
白色念珠菌核酸检测试剂是一种基于聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）的分子生物学方法。
它可以直接检测念珠菌的核酸，从而确认感染的存在以及感染的类型。
传统的方法通常依赖于培养和观察细菌或真菌的生长情况，这需要时间并且很容易出现误诊。
而核酸检测试剂可以在短时间内提供准确的结果，帮助医生更快地做出诊断和制定治疗方案。
在使用白色念珠菌核酸检测试剂时，医生首先会收集患者样本，例如口腔拭子、尿液或血液。
样本中的DNA或RNA将被提取并通过PCR 方法进行扩增。
通过与已知的念珠菌核酸序列进行比对，医生可以确定是否存在感染，并可以确定具体的感染类型。
白色念珠菌核酸检测试剂的主要优势在于其高度准确性和敏感性。
它可以检测到极少量的念珠菌核酸，甚至在感染初期。
这对于那些免疫系统受损或接受抗真菌治疗的患者尤为重要，因为对念珠菌感染的早期干预可以有效地减少并发症发生的风险。
白色念珠菌核酸检测试剂还具有多样化的应用场景。
它可以在不同类型的样本中使用，例如血液、尿液、唾液等，因此可以应对各种可能的感染病症。
它还可以检测出不同的念珠菌类别和亚型，这对于制定个性化的治疗方案来说至关重要。
然而，白色念珠菌核酸检测试剂也存在一些限制。
首先是成本因素，这种新型技术相对较为昂贵，可能限制了其在某些地区和医疗机构的应用。
与传统方法相比，核酸检测试剂的操作和数据分析也需要更高的技术要求，这可能需要专门培训医生和实验室人员。
总结起来，白色念珠菌核酸检测试剂是一种新型的分子生物学技术，可以快速、准确地检测白色念珠菌的感染。
白色念珠菌快速鉴定多种方法白色念珠菌（Candida albicans）是一种常见的真菌感染病原体，常见于口腔、肠道、生殖系统和皮肤等部位。
由于其对抗药物的能力强，对人体的感染具有一定的危害性。
因此，对于白色念珠菌的快速鉴定方法的探索和研究对于及早发现和治疗感染具有重要意义。
为了实现对白色念珠菌的快速鉴定，许多方法和技术已经被开发出来，并且在临床实践中得到了广泛应用。
下面将介绍一些常见的白色念珠菌快速鉴定方法。
首先，常规的实验室方法是通过培养白色念珠菌来鉴定其存在。
这种方法需要将样本（如血液、身体分泌物）接种到培养基上，然后观察并分离出念珠菌。
这种方法的优点是简单易行，但需要较长的培养时间，一般需要1-3天才能得到结果。
为了缩短鉴定时间，一些分子生物学方法也被广泛应用于白色念珠菌的快速鉴定。
其中，聚合酶链式反应（PCR）是最常用的方法之一。
PCR可以通过扩增白色念珠菌的特定基因片段来检测其存在。
由于PCR的高灵敏度和快速性，这种方法在临床实践中得到了广泛应用。
另外，实时荧光定量PCR（qPCR）和循环介导等温扩增（LAMP）也是常用的快速鉴定方法。
除了分子生物学方法外，免疫学方法也被用于白色念珠菌的鉴定。
例如，酶联免疫吸附试验（ELISA）可以通过检测血清中的白色念珠菌特异性抗原来确定感染的存在。
这种方法具有高灵敏度和特异性，但需要较长的实验时间。
近年来，基于质谱法的快速鉴定技术也逐渐成为研究热点。
质谱技术可以通过检测样本中念珠菌特异性的蛋白质或代谢物来确定其存在。
与传统方法相比，质谱法具有高灵敏度、高特异性和较短的分析时间等优势。
综上所述，针对白色念珠菌的快速鉴定方法包括传统的培养方法、分子生物学方法、免疫学方法和质谱法等。
这些方法在临床实践中各具优势，可以根据实际需要选择合适的方法。
未来，随着技术的进步和研究的深入，相信会有更多更快速、准确的方法被开发出来，以改善白色念珠菌感染的早期诊断和治疗。
