肺炎链球菌检测与分型技术

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肺炎链球菌的分离和鉴定ppt演示课件

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6. 凝集试验

包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白 A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。
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表1 非β 溶血链球菌的鉴别

———————————————————————————————————— 菌种 Optochin 胆汁胆汁 6.5%NaCl 吡咯烷卫星现象 CAMP 血清群敏感溶菌七叶苷肉汤酮酶 ———————————————————————————————————— 肺炎链球菌 + + — — — — — — 牛链球菌 — — + — — — — D 无乳链球菌 — — — d — — + B 草绿色链球菌 — — — — — — — — 营养变异链球菌 — — — — + + — — ———————————————————————————————————— *d.不同菌株
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细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
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一、生物学性状
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1. 形态与染色

肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
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2. 培养特点
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3.抗原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。

实时荧光定量PCR法快速诊断肺炎链球菌及其血清分型方法的建立

实时荧光定量PCR法快速诊断肺炎链球菌及其血清分型方法的建立摘要】目的：探讨建立荧光定量PCR法直接检测临床标本的肺炎链球菌并对其进行血清学分型的可行性。

方法：针对肺炎链球菌种属特异性基因lytA及该菌常见的21种血清型设计荧光探针及引物，构建Taqman荧光定量PCR法。

使用荚膜肿胀试验作为金标准检测PCR方法的灵敏度及特异度，选择1209份临床样本同时做培养及PCR方法，比较两种方法的肺炎链球菌检出率及血清分型情况。

结果：构建Taqman荧光定量PCR法灵敏度及特异度分别为94.2%及70%。

Taqman荧光探针PCR法鉴定的主要血清型别为19F（43.7%）、6A/B（17.2%）、23F（13.8%）、19A（6.8%），未能分型的肺炎链球菌为17.2%。

荚膜肿胀试验鉴定的主要血清型别为19F（39.1%）、6A/B（17.2%）、23F（9.2%）、19A（5.7%），未能分型的肺炎链球菌为28.7%。

1209份临床样本仅培养出16份肺炎链球菌，Taqman荧光定量PCR法检出44例肺炎链球菌，其对临床样本肺炎链球菌阳性检出率更高，其差异有显著统计学意义（χ2=13.39，P<0.001）。

结论：Taqman荧光探针PCR法灵敏度高、特异度好，能直接对临床样本进行血清学分型，可大幅度缩短肺炎链球菌检测的报告时间。

【关键词】 Taqman荧光探针PCR法；肺炎链球菌；血清分型；荚膜肿胀试验【中图分类号】R378.1+2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）25-0036-03Establishment of real - time fluorescence quantitative PCR for rapid diagnosis of Streptococcus pneumoniae and its serum typingLiang Zhuoxin, Fu Jinjian, Long Yiqin, Wei Haichun.Guangxi Liuzhou Maternal and Child Health Care Hospital, 1Department of Intensive Medicine, 2Department of Laboratory, 3Department of Pediatrics, 4 Department of Transfusion, Liuzhou 545001, China【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of establishing a quantitative method for the direct detection of Streptococcus pneumoniae in clinical specimensand its serological typing. Methods The fluorescent probes and primers for series of serotypes of Streptococcus pneumonia was designed for the development of Taqman fluorescence quantitative PCR. Capsular swelling test was used as the gold standard to determine the sensitivity and specificity of the PCR method. 1209 clinical samples were selected and cultured at the same time. Results The sensitivity and specificity of Taqman fluorescence quantitative PCR was 94.2% and 70%, respectively. The main serotypes identified by Taqman PCR were 19F (43.7%), 6A / B (17.2%), 23F (13.8%),19A (6.8%) and 17.2% of Streptococcus pneumonia cannot be typed. The main serotypes identified by capsular swelling were 19F (39.1%), 6A / B (17.2%), 23F (9.2%), 19A (5.7%) and 28.7% of Streptococcus pneumonia cannot be typed. Sixteen cases of Streptococcus pneumoniae were cultured positive in 1209 clinical samples, and 44 cases of Streptococcus pneumoniae were detected by Taqman fluorescence quantitative PCR. The positive rate of Streptococcus pneumoniae detected by PCR was significantly hi gher than that of capsular swelling method (χ2 = 13.39, P<0.001). Conclusion Taqman Fluorescence Probe PCR method has high sensitivity and good specificity, and it can detected the streptococcus pneumoniae directly from clinicalsamples and can shorten the reporting time.【Key words】 Taqman fluorescence probe PCR method; Streptococcus pneumoniae; Serotype; Capsular swelling test我国每年因肺炎链球菌相关疾病导致儿童死亡人数列全球前10名[1]。

肺炎链球菌检测讲解

国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上，再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上，并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为严重，多重耐药发生率为75%，高于北京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本鳞状上皮细胞白血球细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活取出保存管自然平衡至室温，接种适合平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手段。

肺炎链球菌的分离和鉴定ppt课件

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肺炎链球菌
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肺炎链球菌
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原结构
（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。 • 琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
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分离培养
1）标本处理
及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。
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胆溶阴性
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4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
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optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的 o35p℃toc孵hi育n纸过片夜，。置抑5菌~1环0直%C径O2>的=大14气mm中为（敏或感烛，缸推），断为肺炎链球菌。抑菌环直径<14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm 以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。

肺炎链球菌的分离及鉴定

第五十页，编辑于星期五：十九点三十分。
肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由
ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导，
其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导，其耐药表型为M，即对14
(1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国
家或地区。
(2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。
过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在
抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来,
或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球
菌之间传播。
研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。
（2）分离培养
1）标本处理
及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低
的主要原因。
第十一页，编辑于星期五：十九点三十分。
2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌
空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。
第四十五页，编辑于星期五：十九点三十分。
6. 凝集试验
包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）
协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。
第四十六页，编辑于星期五：十九点三十分。
表1 非β溶血链球菌的鉴别
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