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多重PCR分型（Multiplex PCR Serotyping）试验开始前，请准备：*分1.2.3. 扩增条件：步骤温度时间预变性95℃15min循环-1 94℃30s循环-2 54℃90s循环-3 72℃60s30个循环延伸 72℃10min保存终止反应后保存于4℃4. 扩增顺序及引物组成：所有引物的工作浓度均为25µM ，下列表中所列体积均为每个25µl 反应中应加入引物的体积。
在每个反应中，内对照引物扩增均应呈阳性。
Reaction 1引物名称 体积µl （V/25µl ） 扩增片段长度bpcpsA-F 0.1160cpsA-R 0.1 6A/B/C-F 0.32506A/B/C-R 0.3 6C-F0.37276C-R 0.3对于Reaction 1和Reaction 1 Supplement未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 2扩增。
Reaction 2引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp38/25F-F 0.3 57438/25F-R 0.335B-F 0.567735B-R 0.5对于Reaction 3未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 4扩增。
Reaction 4引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp160cpsA-R 0.1cpsB-F 0.4cpsC-R1 0.2 1187（A）cpsC-R2 0.2 980（B）19FcpsO-F 0.2814（C）19FcpsO-R 0.2若扩增片段为A+C，则为18F若扩增片段为B+C，则为18B/18C若扩增片段为C，则为18A对于Reaction 4和Reaction 4 Supplement未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 5扩增。
Reaction 5引物名称体积µl（V/25µl）扩增片段长度bp5-R 0.335F/47F-F 0.351735F/47F-R 0.317F-F 0.569317F-R 0.5对于Reaction 6未出现血清群/型特异性扩增的样品，进行Reaction 7扩增。
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
荚膜肿胀分型试验
（Quellung Typing）
试验开始前，请准备：
1%甲基兰溶液。
试验步骤：
1.用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，配制3.0麦氏
单位菌悬液。
2.分别吸取分型血清和1%甲基兰溶液各5µl于载玻片上充分混合。
3.在步骤2的混合液中添加5µl步骤1的菌悬液，混合均匀。
4.盖上盖玻片，室温下静置3min。
5.100x油镜下观察试验结果。
尽量在半小时内观察结果，勿要使两个玻璃片间
的液体干燥。
如果镜下观察：荚膜涨起可见（菌体自身肿胀）、菌体周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。
将血清分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
利用荚膜肿胀法，采用丹麦Statens Serum Institut公司生产的Pneumotest Kit对肺炎链球菌血清型/群进行鉴别，判定流程如下：
再将菌悬液分别与血清P-T反应；
交叉凝集判定具体血清型/群。
例如一份样品分别与血清B和R反应，则此标本为血清群3肺炎链球菌。
*Sørensen UBS., Typing of Pneumococci by Using 12 Pooled AntiAntisera, J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 2097-2100.。
肺炎链球菌的鉴定方法来源：检验医学网细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
