下载文档原格式
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
菌落形态鉴定
（Colony Morphology Test ）
试验开始前，请准备：
哥伦比亚血琼脂平板于室温下平衡至少20min。
试验步骤：
1.将疑似标本以三区划线方式接种于哥伦比亚血琼脂平板上。
℃2条件下培养18-20h。
2.35 5%CO
3.挑取疑似菌落，典型菌落形态：脐窝状，灰白色，半透明，草绿色溶菌环。
常见肺炎链球菌菌落形态：草绿色溶血环，灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落；或草绿色溶血环，中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落；或草绿色溶血环，表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落。
4.挑取单个疑似肺炎链球菌菌落，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35℃条件下
培养18-20h。
5.进行其他肺炎链球菌特异性鉴定。
将菌落形态观察结果及时添加至
Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
本手册仅供实验室内部使用 2011年第1
版。
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。
测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。
本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。
2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。
2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。
3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。
4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。
5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。
6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。
7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。
4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。
活菌的计数应在24小时内完成。
活菌数的检测应重复3次并取平均值。
实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。
5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。
通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。
6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。
科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。
注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
多位点序列分型（Multi Locus Sequence Typing）试验开始前，请准备：冰浴。
扩增体系配制及样品添加过程需在冰浴上操作。
将冷冻保存的试剂取出，室温放置融化后冰浴上备用；Taq酶直接放置在冰浴上。
1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml）。
试验步骤：1.待测样品的DNA制备；冷冻保存的DNA室温下自然融化后，冰浴放置备用。
2.扩增体系配置（50µl/reaction）：成分名称体积（µl）10Xbuffer（含MgCl2） 5dNTP（10mM） 1Primer F（20µM） 0.5Primer R（20µM） 0.5Taq（5U/µl） 1DNA 5H2O 373.扩增条件：步骤温度时间预变性 94℃ 3min循环-1 94℃ 30s循环-2 56℃ 30s循环-3 72℃ 30s30个循环延伸 72℃ 5min保存4℃4.扩增产物验证：将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶（含DNA染料4µl/100ml），100V，电泳40min；片段长度600-800bp。
5.产物纯化后，连同相应的测序引物送交测序公司测序（每个样品配5µl上、下游测序引物，引物浓度10µM）。
6.得到序列信息后，递交到相关网站进行序列比对，确定ST，/sql/singlelocus.asp；将分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
Reference*/misc/info.asp。
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。
其识别需要准确可靠的实验室检测。
以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。
在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。
培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。
培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。
α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。
生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。
Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。
抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。
常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。
分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。
PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。
血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。
血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。
耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。
常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。
耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。
综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。
准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。
优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。
综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。
分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。
培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。
荚膜肿胀分型试验
（Quellung Typing）
试验开始前，请准备：
1%甲基兰溶液。
试验步骤：
1.用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，配制3.0麦氏
单位菌悬液。
2.分别吸取分型血清和1%甲基兰溶液各5µl于载玻片上充分混合。
3.在步骤2的混合液中添加5µl步骤1的菌悬液，混合均匀。
4.盖上盖玻片，室温下静置3min。
5.100x油镜下观察试验结果。
尽量在半小时内观察结果，勿要使两个玻璃片间
的液体干燥。
如果镜下观察：荚膜涨起可见（菌体自身肿胀）、菌体周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。
将血清分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
利用荚膜肿胀法，采用丹麦Statens Serum Institut公司生产的Pneumotest Kit对肺
炎链球菌血清型/群进行鉴别，判定流程如下：。
肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。
肺炎球菌菌体似矛头，呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜。
近年来，越来越多的国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。
1、药敏试验1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链球菌药敏试验的参考方法。
该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。
将在羊血平板上的菌落制备菌液，以0.5浊度分装微量板。
在35℃普通条件下培养24h后，人工判断结果。
具体MIC见NCCLS的判定标准。
1.2纸片扩散法NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。
对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。
平板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。
抑菌环的大小和质控标准详见NCCLS的规定。
纸片扩散法的优点是简单方便，对非β-内酞胺药物的重复性、准确性均较高，但是在应用于青霉素和头抱类抗生素时准确性明显降低。
2、肺炎链球菌的耐药性检验目前有很多实验室在对血液、脑脊液等体液分离得到的肺炎链球菌耐药性测定时，只检测青霉素的耐药性。
事实证明，多重耐药和对三代头抱耐药的肺炎链球菌越来越多，因此，NCCLS已经明确要求，从脑膜炎者分离出来的肺炎链球菌必须做青霉素、头孢曲松或者头孢他啶的MIC，另外还应检测对万古霉素的耐药性。
对于中枢神经系统以外分离而来的肺链球菌，则首先应该选用苯唑西林来检测其是否对β-内酰胺类药物耐药。
若抑菌环>200mm，证明其对青霉素和β-内酞胺类药物敏感物耐药性；若抑菌环<19mm，则须进一步检测其对青霉素、头孢曲松或头孢他啶的耐药性。
