实验七、GUS组织化学定位

拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。

●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D- 葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm' target=_blank>x-gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。

因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。

该试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将染色液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。

该试剂盒可以配制50ml GUS染色液。

●贮存和效期：X-gluc染色液-20℃保存；GUS染色缓冲液4℃贮存。

自开封之日起有效期一年。

●使用说明：一. GUS染色液配制：X-gluc染色液为50×浓缩液，使用前用GUS染色缓冲液稀释50倍即配成GUS染色液。

如0.1 ml X-gluc染色液加入到5 ml GUS染色缓冲液中，即配成5 ml GUS染色溶液。

该染色溶液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。

二. GUS染色步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染色液中，于25-37℃保温1小时至过夜。

2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。

3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。

注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。

例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。

但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。

当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。

GUS能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。

gus染色原理Gus染色原理。

Gus染色是一种常用的细胞染色技术，用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。

β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸酯的底物，产生游离的葡萄糖醛酸。

Gus染色的原理是利用β-葡萄糖苷酶水解底物后产生的蓝色产物，对细胞或组织进行染色，从而观察β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。

在进行Gus染色之前，首先需要准备Gus染色液和底物。

Gus染色液通常由染色缓冲液、染色底物和其它辅助试剂组成。

染色底物是一种含有葡萄糖醛酸酯的化合物，一般为5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸（X-gluc）。

X-gluc在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生蓝色的沉淀物，用于显示β-葡萄糖苷酶的活性。

辅助试剂通常包括有机溶剂、金属离子螯合剂等，用于增强染色效果和稳定染色产物。

在实际操作中，将待检测的细胞或组织样品加入Gus染色液中进行染色处理。

在适当的温度和时间条件下，X-gluc会被β-葡萄糖苷酶水解，产生蓝色的沉淀物。

通过显微镜观察染色结果，可以直观地了解β-葡萄糖苷酶在样品中的活性和分布情况。

活性高的细胞或组织会呈现出深色的染色，而活性低的则呈现较浅的染色或无染色。

Gus染色技术在植物学、动物学和微生物学等领域得到了广泛的应用。

在植物学中，可以利用Gus染色观察植物各部位中β-葡萄糖苷酶的表达情况，从而研究植物的生长发育过程和应激响应机制。

在动物学中，Gus染色也可用于研究动物胚胎发育过程中的基因表达和细胞分化情况。

在微生物学中，Gus染色可以用于检测细菌和真菌中β-葡萄糖苷酶的活性，从而研究微生物的代谢特性和环境适应能力。

总之，Gus染色技术是一种简单、直观的细胞染色方法，能够有效地检测β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。

通过对样品进行Gus染色，可以为细胞生物学和生物化学研究提供重要的实验数据，促进对生物学问题的深入理解和探讨。

随着生物技术的不断发展，相信Gus染色技术在生命科学领域中会有更广泛的应用和深入的研究。

2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。

MU的激发波长为365nm，发射波长为456，其含量可由荧光分光光度计测出。

因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。

2.1试剂配制1)1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。

2)1mol/L NaH2PO4溶液：15.601g NaH2PO4溶于100ml水。

3)0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。

4)10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。

5)0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。

6)GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。

7)MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。

8)反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3）：称2.12Na2CO3，用水定容到100ml。

9)考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO410ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。

水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达李想;林智敏;陈在杰;王成虎;刘霞;王锋【摘要】将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48 aa为叶绿体转运肽.将该序列与报告基因GUS融合,构建植物表达载体p1300-RCATP-AGS,转化水稻后,检测阳性株叶片的GUS酶活,其GUS蛋白表达效率是未连有叶绿体转运肽的转基因植物的4.2倍左右.%N -terminal sequence of the protein encoded by rice RCA gene was predicted to be a chloroplast transit peptide. The 144bp fragment of this gene was fused with GFP to construct a transient expression vector pGD-RCATP-GFP for genetic transformation. Transient transformation of tobacco was produced by the Agrobacterium - mediated infiltration method. Fluorescence microscopy analyses demonstrated that, in cells expressing the RCATP:: GFP fusion protein, the fluorescence was specifically targeted to chloroplast. Then this fragment was fused with GUS to construct a vector p1300-RCATP-AGS for genetic transformation. To analyze GUS activity for the leaves of the positive plants, we discovered that the RCA TP sequence increased GUS protein expression levels about 3 fold, when compared to without RCA TP sequence.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2013(028)002【总页数】6页(P95-100)【关键词】RCA(二磷酸核酮糖羧化酶激酶);叶绿体转运肽;GUS酶活分析【作者】李想;林智敏;陈在杰;王成虎;刘霞;王锋【作者单位】福建师范大学生命科学学院,福建福州 350000;福建省农业科学院生物技术研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】Q78;S511Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶）是光合作用植物叶片中含量最丰富的蛋白。

gus染色原理Gus染色原理。

Gus染色是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。

β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸的底物。

在实验中，通过对含有β-葡萄糖苷酶的细胞或组织进行Gus染色，可以直观地观察到β-葡萄糖苷酶的活性分布情况，从而对生物学研究提供重要的信息。

Gus染色的原理主要包括底物、酶作用和染色三个步骤。

首先是选择合适的底物，通常使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷（X-Gluc）作为底物，它在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生可染色的产物。

其次是酶作用，β-葡萄糖苷酶在底物的作用下水解产生的产物，这些产物会与染色剂发生化学反应，形成蓝色的沉淀物。

最后是染色，将样品浸泡在染色液中，待染色完成后观察样品的染色情况。

Gus染色的实验步骤相对简单，但在实验过程中仍需注意一些关键的技术细节。

首先是对样品的处理，样品的预处理对实验结果有着重要的影响。

其次是对底物和染色剂的选择，合适的底物和染色剂可以提高实验的准确性和可靠性。

最后是对实验条件的控制，包括温度、时间、pH值等因素的控制都会对实验结果产生影响。

Gus染色技术在生物学研究中有着广泛的应用，特别是在植物和微生物领域。

通过对植物组织进行Gus染色，可以观察到β-葡萄糖苷酶在不同组织和不同发育阶段的表达情况，从而研究植物的生长发育过程。

在微生物研究中，Gus染色也常用于检测转基因微生物中外源基因的表达情况，为基因功能研究提供重要的数据支持。

总的来说，Gus染色是一种简单而有效的生物学实验技术，通过对β-葡萄糖苷酶活性的检测，为生物学研究提供了重要的手段。

在实际应用中，我们需要充分理解其原理和操作技巧，才能更好地利用这一技术进行科学研究。

希望本文对Gus染色的原理有所帮助，谢谢阅读！。

V ol.30,N o.11pp.1135-1139　N ov.,2004作　物　学　报ACT A AG RONOMICA SI NICA第30卷第11期2004年11月　1135～1139页花椰菜花叶病毒(C aMV )35S 启动子在转基因棉花中的表达焦改丽1　孟钊红2　聂安全1　南芝润1　张换样1　李俊峰3　王娇娟1赵俊侠1　李燕娥1　郭三堆4Ξ(1山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;2山西大学生物技术研究所,山西太原030031;3中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266000;4中国农业科学院生物技术研究中心,北京100081)摘　要　利用G US 作为报告基因,通过G US 组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚,R 0代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚G US 基因表达情况,详细阐述了CaM V 35S 启动子在棉花细胞中的表达轮廓。

结果表明,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中G US 基因能稳定表达并遗传给后代细胞;在根、茎、叶细胞中检测到G US 表达活性。

在胚胎发育过程中,最早检测到G US 表达活性的为开花11d 的鱼雷胚和胚乳。

随着胚胎的发育,G US 表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织,表明CaM V 35S 启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。

在花粉和特殊的纤维细胞中,也检测到G US 的表达活性。

资料证明,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

关键词　G US 基因;花椰菜花叶病毒(CaM V )35S 启动子;转基因棉花;胚胎发育;表皮细胞中图分类号:S562Expression of C aMV 35S Promoter in T ransgenic CottonJ IAO G ai 2Li 1,ME NG Zhao 2H ong 2,NIE An 2Quan 1,NAN Zhi 2Run 1,ZH ANG Huan 2Y ang 1,LI Jun 2Feng 3,W ANG Jiao 2Juan 1,ZH AO Jun 2X ia 1,LI Y an 2E 1,G UO San 2Dui 4(1Institute o f Cotton Research ,Shanxi Academy o f Agricultural Sciences ,Yuncheng 044000,Shanxi ;2　Biotechnology Research Institute ,Shanxi Univer sity ,Taiyuan 030031,Shanxi ;3　College o f Marine Life Sciences ,Ocean Univer sity o f China ,Qingdao 266000,Shandong ;4　Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract The CaM V 35S prom oter is the m ost widely used prom oter for driving transgene expression in plants.It is effec 2tive driving transgene expression in both dicots and m onocots.It is usually classified as constitutive prom oter.H owever ,some reports suggest that it is not expressed in all cell and tissue types.In addition ,the available in formation on its expres 2sion profile in all cell and during the early stages of development is incom plete.In this paper ,the expression profile of CaM V 35S prom oter was detailedly described using the G US as a reporter gene in the transgenic cotton.The results of his 2tochem ical assay showed that G US gene could express steadily and transm it to next generation in the course of callus m itotic division and proliferation.Dark blue staining of G US was observed at various stages of somatic embry os (globular ,heart ,topedo ,cotyledon )and the roots ,stems and leaves of R 0.G US positive expression was first detected during the early stages of torpedo embry o and endosperm at around 11days after anthesis.W ith further growth of the embry os ,the G US staining became stronger and spread to throughout the vascular tissues in the cotyledon.Especially G US positive expression is detected in the pollens and special fiber cells.It showed CaM V 35S prom oter was the same active in these specialized epidermal cells.Thus ,our evidences suggest that CaM V 35S prom oter was developmentally regulated during embry ogenesis in cotton.The prom oter could express in m ost cell and tissue types in cotton at various developmental stages.K ey w ords β2glucuronidase (G US )gene ;CaM V 35S prom oter ;T ransgenic cotton ;S omatic embry o ;E pidern cell 早期使用G US 作为报告基因,研究CaM V 35S 启动子在转基因植物中的表达分布情况,主要局限Ξ基金项目:山西省“十五”重点攻关项目(03100521),山西省留学回国人员科技资助项目和国家“十五863”计划项目的一部分。

一、实验目的本研究旨在通过基因工程技术，将目的基因导入植物细胞中，构建转基因植株，并对其表达情况进行检测和分析，以验证目的基因在植物体内的有效表达。

二、实验材料1. 植物材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子。

2. 基因工程工具：质粒载体（pUC19）、目的基因（GUS基因）、限制性内切酶（EcoRI、BamHI）、T4连接酶、DNA标记物、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。

3. 实验试剂：LB培养基、YEB培养基、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、无水乙醇、氯仿、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、NaCl、SDS、Tris-HCl、EDTA、MgCl2、DNA模板制备试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等。

4. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、超净工作台、离心机、恒温培养箱、电泳仪、紫外分光光度计等。

三、实验方法1. 目的基因的克隆与鉴定（1）设计引物：根据目的基因序列，设计一对引物，分别包含EcoRI和BamHI酶切位点。

（2）PCR扩增：以目的基因的DNA模板为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）酶切与连接：将PCR产物进行EcoRI和BamHI双酶切，回收目的基因片段，与线性化的质粒载体连接。

（4）转化大肠杆菌：将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆进行鉴定。

2. 转基因植株的构建（1）农杆菌转化：将鉴定后的重组质粒转化农杆菌EHA105，挑选阳性克隆进行鉴定。

（2）浸染植物组织：将转化后的农杆菌浸染拟南芥种子，培养获得转基因植株。

3. 转基因植株的分子鉴定（1）DNA提取：提取转基因植株的基因组DNA。

（2）PCR扩增：以转基因植株的基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。

（3）电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因片段的扩增情况。

4. 转基因植株的表型鉴定（1）GUS基因表达检测：提取转基因植株的叶片总蛋白，进行GUS活性检测。