现代组织化学技术组织化学ppt课件
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组织学基本技术ppt(共69张PPT)
显微镜技术
根据光源不同，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以
可见光为光源，后者则以电子束为光源。
—、光学显微镜
（一）普通光学显微镜 （三）激光共聚焦扫描显微境
（五）相差显微镜
（七）微分干涉差显微镜
（二）荧光显微镜 （四）暗视野显微镜
（六）偏光显微镜
（八）倒置显微镜
尼康E-600光学显微镜
消 化 分 离 ： 将 组 织 分 离 成 小 块 ， 然 后 利 用 相 应 的 化 学 组涂织片制 ：片将技所术采➢是的随血着液生或命骨科髓学样的品发涂展抹而于不载断玻进片步上的经。瑞氏或姬姆萨染色后的标本。
抗体已失活、浓度过低；
磨片: 用于很药坚硬品的组水织，如溶骨和液牙。将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方
（二）固定
目的：使组织内的蛋白质迅速凝固或
沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽 量保持组织的原有结构和化学组成。
固定液的种类
单纯固定液 ➢ 4%中性甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制，配制后 密封、 4℃保存，保存时间不超过一个月。适用 HE染色和免疫组化。 ➢ 4%多聚甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制。 ➢ 乙醇混合固定液
尼康E-600光学显微镜
普通光学显微镜由二 部分构成： ①光学部分：包括聚 光镜、物镜和目镜； ②机械部分：包括镜 臂、载物台等。
尼康E800荧光显微镜
荧光显微镜由光源、滤片系 统和显微镜三部分构成。光 源为高压汞灯，用以产生波 长短、能量高的紫外光。 原理：紫外光激发标本中的 荧光物质，使之产生各种不 同颜色的荧光，通过观察荧 光的分布与强弱来测定被检 物质。 研究内容：观察组织、细胞 中有自发荧光或经荧光染料 染色或标记的结构。
《组织化学染色》课件
科学研究
通过染色技术，研究人员可 以观察和研究细胞的结构和 功能。
药物开发
染色技术也可以用于药物开 发过程中的药效评估和分析。
组织化学染色的原理
组织化学染色的原理是利用化学反应将染料分子与组织或细胞结构中的特定 成分结合，从而产生颜色反应。
组织化学染色的步骤
1
标本制备
将组织标本收集、固定和包埋，以便进行 Nhomakorabea一步的染色过程。
2
染料选择
根据需要染色的组织或细胞成分特点选择合适的染料。
3
固定和染色
将标本与染料处理，使染料与目标结合，并增强染色效果。
优点和限制
优点
组织化学染色可以提供直观的视觉信息，用 于研究和诊断。
限制
染色结果可能受到多种因素影响，例如标本 质量和染色剂的稳定性。
常见问题和解决方法
1 染色结果不明显
可能因为染料浓度不足，可以尝试增加染料浓度。
常用的染色方法
1 酸性染料
酸性染料常用于染色细胞核和某些细胞器，例如血液涂片中的噬菌体。
2 碱性染料
碱性染料主要用于染色胞浆和细胞骨架，如组织切片中的嗜酸性细胞。
3 特殊染料
特殊染料用于特定类型的细胞或组织元素，例如肿瘤标志物的染色。
染色技术的应用
医学诊断
组织化学染色在病理学中广 泛应用于疾病的诊断和鉴定。
《组织化学染色》PPT课 件
欢迎来到《组织化学染色》的课程！在本课程中，我们将深入探讨组织化学 染色的基本原理、常用方法以及应用领域。准备好扩展您的知识，并让我们 一起开始这个令人兴奋的旅程吧！
染色的定义和作用
染色是一种在组织学和生物学研究中常用的技术，通过使用染料将细胞和组织的特定结构染色，以显示 其形态、组织类型和功能特点。
免疫组织化学染色技术PPT课件
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
17
尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组织化学技术ppt课件
谢 请多
谢！ 指教！
异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致
抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸
酶及生物素等产生非特异性显色；
免疫组化操作经验和体会
• 操作中应注意以下问题：
1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。
• 5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一
种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞 核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现 胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组 织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺 ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞 浆同时阳性。
三、阳性标记组织学特征
• 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，
五、非特异着色特征
• 以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：
（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时 存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星 形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严 重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解 和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反 应只要应用得当仍有助于诊断。
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。
现代组织化学组织化学
5. 酶类:
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基 因位点
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
组织化学技术教程PPT课件
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案例一：乳腺癌组织化学染色分析
总结词
乳腺癌组织化学染色分析是研究乳腺癌的重要手段， 通过染色技术观察癌细胞形态和组织结构变化，有助 于诊断和预后评估。
详细描述
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，组织化学染色分析可 以帮助医生了解癌细胞的分化程度、恶性程度以及转 移情况。在染色过程中，常用的染色方法包括HE染色 、免疫组化染色和特殊染色等。通过观察癌细胞核增 大、核沟、核沟蛋自质等特征，可以判断癌细胞的恶 性程度和分化程度。此外，组织化学染色还可以用于 检测癌细胞转移和浸润的情况，为临床治疗提供依据 。
组织化学技术教程
目录
• 组织化学技术概述 • 组织化学技术的基本原理 • 组织化学技术的实际应用 • 组织化学技术的挑战与未来发展 • 案例分析
01 组织化学技术概述
定义与特点
定义
组织化学技术是一种利用化学反应来 检测组织或细胞内特定化学物质的方 法。
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分析、 可定位分析等。
20世纪初
随着新技术的不断涌现，组织 化学技术得到迅速发展，并逐 渐应用于医学领域。
20世纪中叶
随着免疫组织化学和原位杂交 技术的出现，组织化学技术进 入了一个新的发展阶段。
21世纪
随着Байду номын сангаас白质组学和基因组学研究 的深入，组织化学技术在生命科
学领域的应用越来越广泛。
02 组织化学技术的基本原理
组织样本的获取
解决方案
针对这些挑战，可以采取优化实验条件、改进抗体标记技术、发展新型荧光染料 和探针等措施，提高检测的灵敏度和特异性。同时，加强样本处理和数据分析方 法的研究，提高实验结果的可靠性和可重复性。
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
24
双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
21
PAP法的原理
PTP课件
22
PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
23
PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
PTP课件
3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
PTP课件
4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
PTP课件
5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
现代化工与高新技术课件 第10章--1-化工导论
1. 防止废物的生成比在其生成后再处理更好。 2. 设计的合成方法应使生产过程中所采用的原料最大量地进入产品之
中。 3. 设计合成方法时，只要可能，不论原料、中间产物和最终产品，均
应对人体健康和环境无毒、无害（包括极小毒性和无毒）。 4. 化工产品设计时，必须使其具有高效的功能，同时也要减少其毒性。 5. 应尽可能避免使用溶剂、分离试剂等助剂，如不可避免，也要选用
➢
说明认识一种化学物质对生态的危害性要有一个漫长的过程。
不可降解的塑料的白色污染
10.1.3 科技发展的基本思考—可持续性发展
3. 人类生存安全
可持续性发展--即倡导社会与经 济协调发展的道路
2. 人类生存质量 1. 人类生存
➢ 可持续性发展要依赖科技进步； ➢ 但并非一切科技都支持可持续
性发展。 ➢ 只有满足人类生存、生存质量
17年代学术奖小企业奖变更合成路线变更溶剂反应条将奖设计更安化学奖1996将废生物质转化为动物饲料化学品和燃料替代聚丙烯酸的可降解性热聚天冬氨酸的生产和使用由二乙醇胺催化脱氢取代氢氰酸路线合成氨基二乙酸钠100co用作聚苯乙烯发泡剂的开发和使一种对环境安全的船舶生产1997可使co用作溶剂的表面活性剂的设计和应用一种革命性的脱出光阻性有机物的清洁技术环境友好的布洛芬生产新工艺方法不产生显影定影废液的干法感光成像系一种全新的低毒性能快速降解的杀菌102历届美国总统绿色化学挑战奖获奖及提名项目1023世界各国重视绿色化学与化工181998原子经济性概念的发展微生物作为环境友好催化剂的应新千年技术
吸收了当代化学、物理、生物、材料、信 息等科学的最新理论和技术，是具有明确 的社会需求和科学目标的新兴交叉学科。
是未来化学工业发展的方向和基础, 越来 越受到各国政府、企业和学术界的关注。
中。 3. 设计合成方法时，只要可能，不论原料、中间产物和最终产品，均
应对人体健康和环境无毒、无害（包括极小毒性和无毒）。 4. 化工产品设计时，必须使其具有高效的功能，同时也要减少其毒性。 5. 应尽可能避免使用溶剂、分离试剂等助剂，如不可避免，也要选用
➢
说明认识一种化学物质对生态的危害性要有一个漫长的过程。
不可降解的塑料的白色污染
10.1.3 科技发展的基本思考—可持续性发展
3. 人类生存安全
可持续性发展--即倡导社会与经 济协调发展的道路
2. 人类生存质量 1. 人类生存
➢ 可持续性发展要依赖科技进步； ➢ 但并非一切科技都支持可持续
性发展。 ➢ 只有满足人类生存、生存质量
17年代学术奖小企业奖变更合成路线变更溶剂反应条将奖设计更安化学奖1996将废生物质转化为动物饲料化学品和燃料替代聚丙烯酸的可降解性热聚天冬氨酸的生产和使用由二乙醇胺催化脱氢取代氢氰酸路线合成氨基二乙酸钠100co用作聚苯乙烯发泡剂的开发和使一种对环境安全的船舶生产1997可使co用作溶剂的表面活性剂的设计和应用一种革命性的脱出光阻性有机物的清洁技术环境友好的布洛芬生产新工艺方法不产生显影定影废液的干法感光成像系一种全新的低毒性能快速降解的杀菌102历届美国总统绿色化学挑战奖获奖及提名项目1023世界各国重视绿色化学与化工181998原子经济性概念的发展微生物作为环境友好催化剂的应新千年技术
吸收了当代化学、物理、生物、材料、信 息等科学的最新理论和技术，是具有明确 的社会需求和科学目标的新兴交叉学科。
是未来化学工业发展的方向和基础, 越来 越受到各国政府、企业和学术界的关注。
组织化学技术教程
第三章 组织化学的基本技术
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
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一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
组织化学与细胞化学技术
PAS法显示粘多糖
铅法（ATP酶）
组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察
——对组织或者细胞内特定物质进行定性，定
位， 定量分析
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一、绪论
3. 组织化学与细胞化学技术的主要类型
化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方 法，免疫学方法，分子生物学方法等
常用分类： (1) 一般组织化学与细胞化学 (2) 免疫组织化学与细胞化学 (3) 原位杂交组织化学 * 每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、绪论
4. 组织化学与细胞化学技术的基本要求
(1) 保持组织和细胞的完整性 (2) 被检物质具有不溶性和（或）可视性 (3) 反应具有特异性 (4) 反应具有灵敏性 (5) 可重复性
------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时
的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应，
采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组
织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律
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一、绪论
2. 组织化学与细胞化学技术的特点
普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察
HE染色
HE染色
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现代组织化学技术
组织化学与细胞化学
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一、绪论
1. 什么是组织化学与细胞化学技术？
Histochemistry
and
cytochemistry
------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化 学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学
------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行 定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化 学”
时可先沉淀或者离心；
② 爬片法：贴壁生长的培养细胞；
③ 印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞
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二、标本的制备
2. 固定（fixation）
(1) 固定的目的：
保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化 学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性 非常重要
(2) 固定的优、缺点：
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二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法： 灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感
的器官，如神经系统、胃肠等取材。
包括推注，滴注
滴注步骤(大鼠)：
开胸- 暴露心脏- 自心尖剪开左心室-插入灌流
针至主动脉弓- 固定灌流针-快速注入冲洗液，
剪开右心耳- 先快后慢注入固定液- 慢注毕，
将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱
② 固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，可
在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，保证组织块各个方向都
有利于固定剂的渗入
③ 选择合适的固定剂：根据不同的组织以及后续研究方法的特点选择
磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的保存
优于Bouin固定液
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二、标本的制备
2. 固定
(4) 固定的方法
浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸 渍法和灌注法用的最多
浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好
标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40 倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情 况而定
内静置2h后取材（或立即取材），放入固定
液中进行后固定
大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总
动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血
固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000
毫升不等
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冲洗液 固定液
动物
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二、标本的制备
2. 固定
(5) 影响固定的因素：
① 组织块不宜过大： 组织块过大会影响固定剂的渗透
C. 其他固定剂
铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等
四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微细
结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
② 混合固定剂：
Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等
形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧
甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原决定簇，在免
疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824小时），降低固定
温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗
原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（应用最为广
Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，
是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固定
均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响
Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染
色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用
Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt
泛）、2.5%戊二醛等
戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
B. 凝固沉淀固定剂 丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使
组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存 较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结构会破坏， 因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60 min 为宜。
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二、标本的制备
1. 取材（draw material）
(1) 组织标本取材：
准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当
清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、大小
适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）
(2) 细胞标本取材：
① 涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低
优点：使组织细胞的形态结构得到保持 缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损
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二、标本的制备
2. 固定
(3) 常用固定剂的种类及特点
① 单一固定剂：
A. 交联固定剂
甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨
基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织