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GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。
2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM ED TA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-1004．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRIT ION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%2 0for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf /stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalS taining.pdf/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.p dfGus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassium phosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g --->200mlKH2PO4: 27.2g---->200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4----> 300ml 1M potassium phosphate b uffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use. Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2mol/L Na3PO4缓冲液(62mL0.2mol/L Na2HPO4;38mL0.2 mol/L NaH2PO4)，pH7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4·H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5mlK4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1mlNaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9mlX-Gluc 0.1% 10ul Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
GUS基因组织化学染色
将共培养后的材料从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，切至0.2cm大小，放入离心管中，加入Buffer A至没过愈伤组织，置于37℃环境中，侵泡1 h。
用移液枪将Buffer A 吸出，加入Buffer B至没过愈伤组织，置于37℃黑暗环境中染色，至材料出现蓝色。
若叶绿素影响观察，可用75%乙醇漂洗材料，做脱色处理。
最后用蒸馏水将材料洗净，观察统计染色数。
Buffer A成分如下：
0.2 M NaPO4 buffer （PH 7.0）25 ml
蒸馏水23.75 ml
0.1 M K3[Fe(CN)6] 0.25 ml
0.5 M Na2EDTA 1 ml
Total 50 ml
其中0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由0.2 M Na2HPO4和0.2 M NaH2PO4配制而成。
每100ml的0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由62 ml 0.2 M Na2HPO4和38 ml 0.2 M NaH2PO4混合而成。
Buffer A置于4℃保存。
Buffer B由Buffer A和X-gluc 1：1混合配制而成。
Buffer B置于-20℃，避光保存。
gus染色原理Gus染色原理及应用引言：Gus染色原理是一种常用的实验方法，主要用于检测和定位β-葡萄糖苷酶的活性。
本文将介绍Gus染色原理的基本概念、实验步骤以及其在生物学研究中的应用。
一、Gus染色原理的基本概念Gus染色原理，即β-葡萄糖苷酶染色原理，是通过Gus染色剂对β-葡萄糖苷酶进行染色，从而观察其活性和分布情况。
Gus染色剂是一种人工合成的染料，它能与β-葡萄糖苷酶发生化学反应，形成蓝色沉淀物。
这种染色剂在染色过程中是无色的，但在与酶反应后会产生明显的颜色变化。
二、Gus染色的实验步骤1. 制备Gus染色剂：将Gus染色剂溶解于适当的缓冲液中，制备成一定浓度的染色溶液。
2. 取样：选择待检测的生物组织或细胞，进行取样。
3. 固定：将取样的生物组织或细胞进行固定处理，以保持其形态结构的完整性。
4. 染色：将固定的生物组织或细胞浸泡于Gus染色溶液中，进行染色反应。
5. 观察：观察染色结果，通过显微镜对染色的生物组织或细胞进行观察和记录。
三、Gus染色在生物学研究中的应用1. 植物生物学研究：Gus染色可以用于检测植物中β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况，帮助研究植物生长和发育过程中的基因调控机制。
2. 动物生物学研究：Gus染色可用于检测动物组织和细胞中β-葡萄糖苷酶的表达情况，有助于研究动物发育、疾病发生和治疗等方面的问题。
3. 微生物学研究：Gus染色可以用于检测细菌和真菌中β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况，对于研究微生物代谢途径和菌种鉴定等具有重要意义。
4. 分子生物学研究：Gus染色可以与基因表达报告载体结合，用于检测基因的活性和表达水平，为分子生物学研究提供了一个简便、直观的方法。
结论：Gus染色原理是一种常用的实验方法，通过对β-葡萄糖苷酶的染色反应，可以检测和定位其活性和分布情况。
该方法在植物学、动物学、微生物学和分子生物学等领域具有广泛的应用。
通过对Gus染色原理的了解和掌握，我们可以更好地开展生物学研究，揭示生物体内重要酶的功能和调控机制，为相关领域的研究提供有力的支持。
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸的底物。
在实验中，通过对含有β-葡萄糖苷酶的细胞或组织进行Gus染色，可以直观地观察到β-葡萄糖苷酶的活性分布情况，从而对生物学研究提供重要的信息。
Gus染色的原理主要包括底物、酶作用和染色三个步骤。
首先是选择合适的底物，通常使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷（X-Gluc）作为底物，它在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生可染色的产物。
其次是酶作用，β-葡萄糖苷酶在底物的作用下水解产生的产物，这些产物会与染色剂发生化学反应，形成蓝色的沉淀物。
最后是染色，将样品浸泡在染色液中，待染色完成后观察样品的染色情况。
Gus染色的实验步骤相对简单，但在实验过程中仍需注意一些关键的技术细节。
首先是对样品的处理，样品的预处理对实验结果有着重要的影响。
其次是对底物和染色剂的选择，合适的底物和染色剂可以提高实验的准确性和可靠性。
最后是对实验条件的控制，包括温度、时间、pH值等因素的控制都会对实验结果产生影响。
Gus染色技术在生物学研究中有着广泛的应用，特别是在植物和微生物领域。
通过对植物组织进行Gus染色，可以观察到β-葡萄糖苷酶在不同组织和不同发育阶段的表达情况，从而研究植物的生长发育过程。
在微生物研究中，Gus染色也常用于检测转基因微生物中外源基因的表达情况，为基因功能研究提供重要的数据支持。
总的来说，Gus染色是一种简单而有效的生物学实验技术，通过对β-葡萄糖苷酶活性的检测，为生物学研究提供了重要的手段。
在实际应用中，我们需要充分理解其原理和操作技巧，才能更好地利用这一技术进行科学研究。
希望本文对Gus染色的原理有所帮助，谢谢阅读！。
GUS染色液的配制GUS染色液的配制主要参照Jefferson（1987）的方法。
(1)配制50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）：A液：称取NaH2PO4.2H2O 3.12g 溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4.12H2O 7.7g 溶于溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。
取39ml A液与61ml B液混合。
(2)配制X-Gluc(5-bromo-4chloro-3indolylglucuronide)母液：称5mg X-Gluc，溶于1mlDMF(二甲基甲酰胺)。
(3)染色液配制：磷酸钠缓冲液50 mmol/L（pH7.0），0.1%TritonX-100, 亚铁氰化钾5mmol/L，高铁氰化钾5mmol/L,X-Gluc 0.5mg/ml。
GUS活性的组织化学检测GUS活性的组织化学检测主要参照Jefferson（1987）的方法。
(1)愈伤组织瞬间表达及稳定转化的GUS检测愈伤组织瞬间表达的GUS检测：用带有重组质粒pOsMT2bL-GUS和35S-GUS的农杆菌EHA105感染水稻愈伤，共培养3d后，从每皿中各取10颗愈伤，用蒸馏水清洗除去愈伤表面附着的农杆菌。
滤纸吸干水分。
同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。
肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。
愈伤组织稳定转化的GUS检测：取经两轮抗性筛选后pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因抗性愈伤，同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。
肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。
(2)根、茎、叶中的GUS检测剪取pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因水稻及未转基因水稻成熟植株的根、茎、叶、叶鞘、叶舌叶耳结合部（其中根、茎、叶鞘用解剖刀横切），浸没在染色液中，37℃保温3-20h，转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。
GUS荧光定量分析方法一、GUS 粗蛋白的提取1、取拟南芥组织100mg，用液氮研磨成粉。
2、加入1ml的GUS提取液（pmsf<蛋白抑制剂>），剧烈震荡。
3、12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到GUS粗酶提取液。
二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量按上表加入不同量的BSA标准蛋白溶液，测定OD595的吸光值，并得出曲线方程。
2、样品总蛋白的测定自定合适的比例的稀释GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于1中的0到6之间。
例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟，测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。
三、GUS活性的测定用终止液将MU储备液B按上表稀释成0-250nM,用荧光计在激发波长为350nm,发射波长455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。
2荧光定量1）取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号.2）在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入250ul预热的反应液，混匀。
立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白，并开始计时。
3）将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应，60分钟后，取200ul反应液，加入到2号管中混匀，为反应60分钟时的样品，测定荧光值。
主要溶液的配制：1、GUS提取缓冲液：1)0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）50mL:0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）：557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4定容到1000mL(35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O（156.01）定容到100Ml)2) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL:9.31gEDTA加水剧烈搅拌，加入约1g NaOH, 定容到50 mL.3) 30% 十二烷基肌氨酸钠0.33 mL：1.5g加水定容到504）10% Triton X-100 1 mL:1 mL Triton X-100 加9 mL水混匀5）β-巯基乙醇0.07-0.10 mL（马琳论文里面有）6）甲醇 20ml（网上有的文献里有）蒸馏水定容至100mL。
GUS 活性检测目的：通过Gus活性测定了解或研究Gus基因是否转化进入植物细胞；Gus基因在植物组织、细胞内的表达部位；Gus基因在植物细胞内瞬时表达量及稳定表达量；外源基因在植物细胞内的表达调控。
材料：转化的植物组织、器官、原生质体、种子的胚及萌发的幼苗等。
一、组织化学染色法试剂：(1)200mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。
取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O 调至7.0。
(2)＊说明：GUS活性的精确定位需要有亚铁离。
GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2－，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。
(3)FAA固定脱色液：5％甲醛，5％乙酸，5％乙醇。
材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后1-5天的材料，稳定表达取转化后处理6周后的材料。
(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。
(3) 悬浮细胞、原生质体低速离收集，无菌等渗液洗涤。
(4) 清洁的愈伤组织可以直接使用直接染色法(1)将准备好的材料浸泡在染液中，于25-37℃保温1小时至过夜。
(2)叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。
(3)肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
固定染色法(1)将材料浸入固定液中，必要时可抽真空1分钟，室温下轻摇30-60分钟。
(2)取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3-4次。
2.6 GUS瞬时表达2.6.1GUS组织化学染色底物X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly glucuronide)在GUS活性作用下水解产生无色的吲哚衍生物，此无色衍生物发生氧化二聚作用形成一种蓝色的不溶性的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，使表达GUS的细胞被染成蓝色。
通过肉眼或者显微镜可明显观察到染色情况，并由此检测GUS的表达情况。
将除菌后的材料转移至微量离心管中，加适量的X-Gluc工作液，置于37 ℃黑暗条件下12 h，观察蓝色斑点的形成情况。
于显微镜下观察染色情况并拍照。
2.6.2实验统计和分析均匀取少量待检测的材料于200 μL的离心管中，每次取10 管，以每管中的蓝色比率进行计算，根据观察可分为四个计数基数分别为0、1/3、2/3、1，求平均值。
2.7 荧光分光光度法测定GUS活性原理：以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）简写为（4-MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）（4-methylumbelliferone）及β-D葡萄糖醛酸。
4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。
2.7.1药品试剂：（1）GUS提取缓冲液（100mL）：50mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）：96 mL10mmol/L β-巯基乙醇：100 uL0.5mol/L EDTA（pH 8.0）： 2 mL0.1%（V/V）Triton X-100：100 uL10% Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠) ：0.1g（溶于上述溶液中）ddH2O up to 100mL①50mmol/L 磷酸钠缓冲液(PBS)（pH 7.0）：(定容至500 mL)NaH2PO4·2H2O ：1.5215 gNa2HPO4·12H2O ：5.462 g②0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：在800 mL水中加入186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶解至pH值至约8.0（约需20 g NaOH颗粒），然后定容到1 L。
