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蜡样芽孢杆菌发酵产脂肪酶的分批发酵动力学欧志敏;马兰【摘要】对蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus CGMCC No.12336发酵生产脂肪酶的动力学模型进行了研究.分别测定了B.cereus CGMCC No.12336发酵过程中菌体细胞质量浓度、脂肪酶的活性浓度和还原糖的质量浓度,运用Logistic,Luedeking-Piret等方程对实验数据进行了非线性拟合,阐明了B.cereus CGMCC No.12336分批发酵过程中菌体细胞生长、产物合成和基质消耗的动力学模型并拟合得到了动力学参数.为检验动力学模型的可靠性,对得到的模型进行了实验验证.结果表明:动力学模型与实验数据拟合良好,能较好地描述B.cereus CGMCC No.12336分批发酵过程的动力学特征.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2017(046)001【总页数】5页(P1-5)【关键词】蜡样芽孢杆菌;脂肪酶;分批发酵;动力学模型【作者】欧志敏;马兰【作者单位】浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】TQ92微生物脂肪酶作为有机合成中一种重要的生物催化剂,可以用来催化水解、氨解和醇解等反应[1],且具有区域选择性、底物专一性、成本低、反应条件温和[2]、环境友好、对映选择性高以及不需要辅酶等优点[3],在手性药物的合成、生物传感器和食品加工等领域具有广泛的应用[4].来源于微生物的脂肪酶一般为胞外酶,并且具有相对比较广泛的温度和pH作用范围[5],因此微生物脂肪酶更适用于工业生产和应用,随着非水相酶学、固定化技术[6]和界面酶学等生物技术的发展[7],微生物脂肪酶被越来越广泛地应用.目前对微生物发酵产脂肪酶的研究多在菌种筛选、发酵条件优化和脂肪酶的分离纯化等方面,而对脂肪酶发酵动力学的研究较少.以从土壤中筛选到的B. cereus CGMCC No.12336作为出发菌株,在优化该菌株发酵条件的基础上,研究其动力学特征.运用Logistic,Luedeking-Piret等方程,用软件模拟动力学方程,获得了菌体细胞生长、脂肪酶的生成和基质消耗的动力学模型曲线及动力学参数,为以后放大实验、工业化生产的优化与控制提供了可靠的实践基础和理论依据[8].1.1 菌种浙江工业大学校园土壤中筛选得到的B. cereus CGMCC No.12336,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.1.2 材料斜面固体培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,葡萄糖9,琼脂20.发酵培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,氯化钠2,硫酸镁0.5,葡萄糖9,磷酸二氢钾2,磷酸氢二钾2.主要化学试剂:(R)-(-)-扁桃酸、(R)-(-)-扁桃酸乙酯,上海笛柏化学品技术有限公司.1.3 培养条件发酵培养:250 mL的锥形瓶中含有发酵培养基100 mL,培养获得的种子液按体积分数10%的接种量接种至锥形瓶中,然后置于温度30 ℃和转速180 r/min的恒温摇床上培养38 h.1.4 分析方法1) 菌体质量浓度的测定:发酵液8 000 r/min离心10 min,离心得到的湿菌体用蒸馏水洗两次,然后置于已称重的坩埚中,于80 ℃的恒温干燥箱中烘干至恒重,称重[9].细胞质量浓度以细胞干重计算.2) 酶活测定:取1 mL发酵液,加入20 mmol/L(R)-(-)-扁桃酸乙酯,于30 ℃,180r/min恒温摇床上反应4 h后,高效液相色谱(HPLC)分析测定其转化率[10].色谱条件为:色谱柱是反相C18柱(0.46 mm×250 mm),流动相是由水(含有3.0 mmol/L CuSO4和6.0 mmol/L L-苯丙氨酸)和甲醇构成,体积比为90∶10,流速是0.5mL/min,UV检测波长是300 nm[11].本研究中单位酶活定义为每小时转化1 mmol(R)-(-)-扁桃酸乙酯生成相应的(R)-(-)-扁桃酸所需要的酶量为l U.3) 还原糖含量测定:DNS法[12].4) 试验数据的获得:摇瓶中发酵培养B. cereus CGMCC No.12336,每2 h取一次样,测定菌体细胞干重、脂肪酶活性浓度和还原糖质量浓度在不同时间段的数据,每组都做3次平行实验,求平均值.1.5 数据处理采用Origin 8.0软件对实验获得的数据进行非线性拟合,得出发酵动力学模型及动力学参数[13].1.6 构建发酵动力学模型的理论1.6.1 菌体生长模型用Monod方程可以描述菌体细胞的生长,但Monod方程所描述的是均衡生长的模型,实际上分批发酵的过程比较复杂,不能将菌体质量浓度及底物对生长的限制忽略,所以菌体细胞生长模型用Monod方程来表述并不适合[14].在发酵过程中,随着菌体质量浓度的不断增加,会抑制菌体细胞的生长,对此有较好描述的是Logistic方程[15],所以拟合菌体细胞生长过程使用的是Logistic方程[16].Logistic方程为以t=0时,X=X0为初始条件,式(1)积分后,可得式中:X为细胞质量浓度(干重);X0为初始细胞质量浓度(干重);Xm为最大细胞质量浓度(干重);μm为最大比生长速率;t为发酵时间.求得参数X0,Xm,μm值即可完成上述模型.1.6.2 产物生成动力学模型在发酵过程中,基于菌体生长与产物生成的关系,Gaden将产物的生成分为三类[17]:1) 产物的生成和菌体细胞的生长是相耦联的,即两者之间存在直接相关的关系;2) 产物的生成和菌体细胞生长的关系是部分耦联的,即两者存在的仅仅是间接的关系;3) 产物的生成与菌体细胞的生长无联系,即两者不相关.从图1中得出:脂肪酶的活性浓度是随着菌体细胞质量浓度的增加而增加的,但在发酵末期菌体细胞的生长进入了稳定期,菌体细胞的质量浓度基本上是不变的,但脂肪酶活性浓度还是在继续上升的,由此可以得出脂肪酶的产生过程是生长部分耦联型.Leudeking-Piret方程用来表述产物合成过程[18],即式中:α≠0,β≠0表示的是生长部分耦联;α≠0,β=0表示的是生长耦联;α=0,β≠0表示的是非生长耦联.将式(1)代入式(3),以t=0时,P=0为初始条件,积分后得式中:α是和生长有关的产物合成参数;β是和生长无关的产物合成参数.求参数α,β的值即可建立产物生成动力学模型.1.6.3 基质消耗动力学模型在分批发酵过程中,底物为葡萄糖,主要用于菌体细胞的生长,菌体细胞维持生命的能量消耗和产物的合成[19].由于产物的合成与菌体生长存在关系是呈部分相关的,因此可以使用类似于Leudeking-Piret的方程来表述基质消耗的模型[20],即分批发酵过程中,由于产物的生成和菌体细胞的生长是部分相关的关系,即底物的消耗和产物的生成相关关系是间接的,因此可以假设很小的一部分基质是用于产物合成的,是可以忽略的,即葡萄糖主要用于菌体细胞代谢的维持和菌体细胞生长[21].式(5)可以写为将式(1)代入式(6)积分后得式中:S为基质质量浓度;S0为发酵初始葡萄糖质量浓度;m为细胞的维持系数;YX/S 表示菌体对底物的得率系数;YP/S表示产物对底物的得率系数.求得参数S0,YX/S,m的值即建立基质消耗动力学模型.2.1 脂肪酶发酵过程代谢变化特征由图1可知:0～6 h是菌体细胞生长的适应阶段,菌体生长缓慢,耗糖量较少,脂肪酶活性浓度也很低;6～18 h菌体细胞快速增长,菌体生长处于对数生长期,耗糖量明显上升,脂肪酶活性浓度也随着菌体量增加而快速上升;18～30 h菌体量继续增加,并在30 h时达到最高值5.21 g/L,发酵液中葡萄糖质量浓度下降减慢且处于较低水平,但脂肪酶活性浓度持续增加;30 h后细胞生长进入稳定期,发酵液中菌体和葡萄糖质量浓度几乎不变,但脂肪酶活性浓度还继续升高,于38 h达到峰值为767 U/L.并由图可知：细胞生长曲线大致为S形,葡萄糖消耗曲线则是反S形,脂肪酶的合成与菌体细胞的生长呈部分耦联的关系.2.2 菌体生长动力学模型在菌体细胞生长动力学研究过程中发现,菌体细胞在经过短暂的迟缓期后,进入对数生长期,之后趋于稳定(图1).用Logistic方程描述菌体细胞生长过程,用origin软件对实验所得的数据进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1).图2为菌体生长动力学模型拟合结果(R2=0.994),由拟合结果可知：B. cereus CGMCC No.12336的生长发酵过程可以用该模型进行较好地表述[22],即菌体细胞生长速率模型为2.3 脂肪酶合成动力学模型脂肪酶合成过程用Leudeking-Piret方程来描述,使用origin软件对实验数据进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1).图3为产物合成模型拟合结果(R2=0.998),由此可知模型能较好地描述产物合成过程,即脂肪酶合成速率模型为2.4 基质消耗动力学模型在发酵过程中,葡萄糖主要用于细胞生长和代谢的维持,用origin软件对其进行非线性拟合,得到了模型和参数值(表1),图4为基质消耗模型拟合结果(R2=0.997).由此可知葡萄糖消耗情况可以用该基质消耗模型较好地表述,即基质消耗速率模型为2.5 拟合曲线分析为检验模型的可靠性,在相同发酵条件下进行3次重复实验,对比实验的平均值与模型预测值[23],表2为比较结果.由表2可以看出:实验平均值与模型预测值两者之间的相对误差大部分都是在±10%以下,但在菌体细胞生长的迟缓期、脂肪酶合成的初期和基质消耗的末期相对误差已大于10%,可能是因为菌体发酵过程复杂,难以控制发酵初期菌体细胞质量浓度和发酵末期葡萄糖的质量浓度,导致低浓度区域相对误差较大,但总体上对发酵结果的影响不大,拟合结果较好.由验证结果可知,B. cereus CGMCC No.12336的分批发酵的过程能很好地用该发酵动力学模型来描述.运用非线性拟合得到了B. cereus CGMCC No.12336分批发酵过程中菌体细胞生长、脂肪酶的生成和基质消耗的动力学模型.脂肪酶发酵过程用该模型能够较好地描述,模型的预测值能够较好地拟合实验值.因此,该模型可以用来预测脂肪酶在发酵过程中浓度变化,优化控制发酵过程,为进一步放大实验和规模化生产奠定基础.【相关文献】[1] 兰立新,肖怀秋.微生物脂肪酶应用研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(14):7547-7548.[2] 林春绵,杨浩,魏敏,等.丙烯腈降解菌的筛选及应用研究[J].浙江工业大学学报,2015,43(5):527-531.[3] 张开平,惠明,田青,等.微生物脂肪酶的应用领域及研究进展[J].河南工业大学学报,2012,33(1):90-94.[4] 李宇辉,刘成江,王俊钢,等.微生物脂肪酶的性质及应用研究现状[J].食品工业,2013,34(9):162-165.[5] 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微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
生物柴油生产技术的研究进展赖红星;万霞;江木兰【摘要】生物柴油作为一种新兴的生物能源,以其可降解性、可再生性等优良品性受到人们极大的关注.生物柴油生产技术从最初的直接使用法、稀释混合法等到后来的酸/碱催化法、生物酶法、超临界法,经历了漫长的发展过程.综述了国内外生物柴油生产技术的优缺点及其研究进展.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)005【总页数】6页(P11-15,20)【关键词】生物柴油;生产技术;物理法;化学法;生物酶法;超临界法【作者】赖红星;万霞;江木兰【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院研究生院,北京,100062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;湖北省能源油料作物与生物柴油研究中心,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;湖北省能源油料作物与生物柴油研究中心,湖北,武汉,430062【正文语种】中文【中图分类】TQ914.3生物柴油是指动植物油脂、餐饮废油等与低碳醇反应所得的脂肪酸甲酯(或乙酯)。
近年来，由于石油价格持续飚升和生物柴油的环境友好性，生物柴油的价值日益凸显。
制备生物柴油的方法可以归为四类：物理法、化学法、生物酶法以及超临界法。
作者在此简要概述了国内外生物柴油生产技术的优缺点及其研究进展。
1 物理法物理法是指通过物理机械的作用，将动植物油脂与石化柴油按比例混合，得到的油品因掺入了一定的动植物油脂而被称为生物柴油。
根据混合方式的不同，物理法分为直接使用法、稀释混合法和微乳化法三种。
1.1 直接使用法直接使用法迄今已有100多年的历史，柴油机的发明者Rudolph Diesel当初就是用花生油为燃料做测试的[1]。
1981年，Bartholomew提出了用食物作燃料的概念，并且指出植物油和酒精必将取代石油，可再生能源一定会取代不可再生能源。
