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化学与生物工程2007,Vol.24No.7 Chemistry &Bioengineering43 基金项目:滨州医学院科研启动基金项目(B Y2005KYQD28)收稿日期:2007-03-15作者简介:李燕妮(1980-),女,山西临汾人,硕士,助教,主要从事发酵工程研究。
E 2mail :lyn0158@ 。
南极假丝酵母产脂肪酶在15L 发酵罐中培养条件的研究李燕妮1,衣婷婷2,李龙森1(1.滨州医学院基础学院,山东烟台264005;21山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘 要:对15L 发酵罐中南极假丝酵母(C 1antarctica DSM3855)的发酵工艺条件进行了研究,确定了最适的产酶工艺条件:搅拌速度为300r ・min -1,通气量为10L ・min -1,接种量为10%,添加GPE 作为消泡剂。
在此培养条件下,培养54h 产酶达到高峰值,最高酶活力达到1913U ・mL -1。
关键词:发酵;南极假丝酵母;发酵罐中图分类号:Q 932335 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)07-0043-02 南极假丝酵母产脂肪酶是一种重要的脂肪酶,具有许多优良的特性,对相当广泛的底物显示出很高的对映选择性,因此在有机合成、制药、医药中间体等领域得到广泛应用[1～3]。
目前,生产脂肪酶的培养基成本较高,发酵周期长,使南极假丝酵母产脂肪酶生产成本较高。
作者采用了廉价的培养基进行大罐发酵,可以很大程度上降低成本。
1 实验111 菌种和培养基南极假丝酵母C.ant arctica DSM3855(本实验室保存)。
斜面培养基、液体种子培养基、发酵培养基[4]。
112 方法11211 工艺流程保藏菌种→斜面活化→平皿培养→种子液摇瓶培养→15L 发酵罐培养11212 种子培养从新鲜斜面上取两环菌C.ant arctica ,接种到25mL (250mL 的三角瓶)种子培养基中,24℃下回转式摇床200r ・min -1振荡培养16h ,制成种子液。
酶催化多功能性研究进展胡居吾;付建平;韩晓丹;徐国良;王慧宾;熊伟【摘要】酶催化反应具有高选择性、条件温和和可再生等优点,是一种绿色环保的有机合成方法。
近年来人们发现酶具有催化非天然底物发生天然反应或非天然反应的能力。
这种独特的能力被定义为酶催化多功能性,近年来备受人们的关注,为有机合成开辟了新的途径。
因此研究酶催化多功能性具有重要意义。
本文叙述了酶的多功能性在催化aldol缩合,Mannich反应,Michael加成反应以及多米诺反应中的应用,展望了酶催化多功能性的研究趋势。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】6页(P59-64)【关键词】酶催化多功能性;合成;反应【作者】胡居吾;付建平;韩晓丹;徐国良;王慧宾;熊伟【作者单位】江西省科学院应用化学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q55酶一直以来被认为是一种高效、专一，对一定反应具有高度识别性的生物催化剂，且已被应用到有机化合物的合成中[1]。
然而，近年来，越来越多的酶被发现可以催化除天然反应以外的一种甚至多种反应类型，这种特性被称为催化多功能性（Catalytic Promiscuity）。
根据Hult和Berglund的报道[2]可以把酶催化多功能性分为3种类型。
第一种，底物多样性，即一种酶可以催化非天然底物进行天然反应；第二种，反应条件多样性，即酶可以在不同于天然反应条件的催化环境中表现出催化活性，例如一些酶已经被证明可以在有机溶剂、各种pH和温度条件下催化有机反应。
第三种，催化反应多样性，通过同一个活性位点或者不同活性部位亦或引入新的活性位点催化各种反应类型，这些反应在键的断裂、形成和机理上都与酶催化天然底物的反应不同[3]。
一般说的酶催化的多功能性指的都是第三种类型，酶催化非天然底物的反应，这些反应中键的断裂、形成和机理都与酶催化天然底物反应不一样。
当然，催化多样性都不可避免地会涉及到引发反应的条件、各种非天然底物和分子机理[4]。
DOI：CNKI:11-1759/TS.20120210.1743.006 网络出版时间：2012-02-10 17:43网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20120210.1743.006.html微生物脂肪酶的研究与应用刘虹蕾，缪铭，江波 ，张涛(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。
随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注。
作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。
本文探讨了脂肪酶的来源、理化性质、脂肪酶活力测定，同时对脂肪酶的非水相催化特性以及脂肪酶在食品工业，医药、洗涤剂、皮革、造纸和生物柴油工业领域中的应用进行了讨论。
关键词：脂肪酶；酶活测定；非水相；食品工业应用Research and applications of microbial lipasesLiu Hong-lei, Miao Ming, Jiang Bo, Zhang Tao(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: lipases are a class of enzymes which catalyse the hydrolysis of esters and esterification of fatty acid andalcohol. Lipases constitute the most important group of biocatalysts for biotechnological applications. This reviewdescribes physicochemical origin and properties of lipases, lipase activity determination, catalytic properties oflipases in nonaqueous phase and various industrial applications of microbial lipases in the food, pharmaceuticals,detergent, leather, papermaking and biodiesel.Key words: lipases; lipase actiity determination; Nonaqueous phase; food industrial applications脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3），是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。
响应面法优化皱褶假丝酵母脂肪酶催化合成甾醇共轭亚油酸酯朱振南;徐莉;张后今;闫云君【摘要】The synthesis of sterol conjugated linoleic acid ester catalyzed by Candida rugosa lipase in n hexane system was investigated.Based on the single factor experiment,the synthesis conditions were optimized by response surface methodology (RSM)using esterification rate of phytosterols as the evaluation index.The results indicated that the optimal synthesis conditions were as follows:molar ratio of conjugated linoleic acid to phytosterols 6∶1,reaction temperature40 ℃,lipase dosage 9.6％ (based on the mass of substrates)and reaction time 87 h.Under the optimal conditions,the esterification rate reached 97.5 ％.%以皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶为催化剂,在正己烷体系中催化植物甾醇与共轭亚油酸合成甾醇共轭亚油酸酯.以植物甾醇酯化率为考察指标,通过单因素实验和响应面实验确定最佳工艺参数为:酸醇摩尔比6∶1,反应温度40℃,酶用量9.6％(占底物质量),反应时间87 h.在此条件下,酯化率达97.5％.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2013(038)007【总页数】4页(P40-43)【关键词】皱褶假丝酵母脂肪酶;植物甾醇;共轭亚油酸;甾醇共轭亚油酸酯;响应面法【作者】朱振南;徐莉;张后今;闫云君【作者单位】华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074;华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074;华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074;华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】TS229;TS218植物甾醇主要来源于植物油，结构类似于胆固醇，能显著降低人体血液中低密度脂蛋白胆固醇的含量，从而降低心血管疾病的发病率［1］。
褶皱假丝酵母脂肪酶催化反应条件的研究陈贵佺，郑二丽（广州市凯虹香精香料有限公司，广东广州 510550）摘要：本文研究了褶皱假丝酵母脂肪酶的催化反应条件。
通过单因素试验研究了温度、缓冲液pH值、酶的浓度对酶活性的影响，并通过正交设计实验对单因素得到的结果进行优化，得到了褶皱假丝酵母脂肪酶的最适反应条件，即温度55 ℃、缓冲液pH值6.0、酶的浓度100 mg/mL，在此条件下，获得的100 mg/mL CRL酶的活力为39.78 mU，CRL酶适合在60 ℃以下温度环境中进行反应，并且适合保藏在pH值5.0~7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。
关键词：脂肪酶；阿魏酸乙酯；酶活文章篇号：1673-9078(2013)4-826-828Catalytic Activity of Candida rugosa LipaseCHEN Gui-quan, ZHENG Er-li(Guangzhou Kaihong Flavor & Fragrance Co., Ltd, Guangzhou 510550, China) Abstract: In this paper, the activity of Candida Rugosa lipase (CRL) in catalyzing hydrolysis reaction was investigated through single factor experiment. And the optimal reaction conditions for CRL catalyzed hydrolysis were obtained as follows: temperature 55 ℃, buffer pH 6.0, and enzyme concentration 100 mg/mL. Under these conditions, the activity of 100 mg/mL CRL was 39.78 mU. CRL was suitable for catalysis at temperatures below 60 ℃and was stable when stored in buffer solution at pH values of 5.0~7.0.Key words: lipase; ethyl ferulate; enzyme activity脂肪酶是一类可以催化甘油三醋合成和分解的酶的总称，主要水解由甘油和12个碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油酯[1]。
它同时还可以催化酯交换反应，广泛分布于动物、植物和微生物组织和器官中[2]。
天然底物是油脂，具有对油/水界面的亲和力，能在油/水界面上催化酯水解或醇解、醋合成、酯交换、内酷合成、多酯合成、高聚物合成及立体异构拆分等有机合成反应，广泛应用于皮革、皮毛、绢纺、食品、医药等行业，特别在洗涤剂、油脂化学、有机化工、制药等领域有着重要的作用[3]，是目前被重点研究的酶催化剂。
脂肪酶可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成[4]、多酯合成[5]、聚合物的合成[6]和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分[7]和手性药物的合成[8]成为酶工程领域研究的新热点。
因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到了广泛应用。
褶皱假丝酵母脂肪(Candida rugosa lipase，CRL)广泛应用于化工制药、油脂、食品等传统与现代工业，是目前全世界工业应用最广泛的商品化脂肪酶之一。
收稿日期：2012-12-13作者简介：陈贵佺(1984-)，男，工程师，硕士研究生，食品生物技术本文通过研究褶皱假丝酵母脂肪酶的催化反应活性并获得了它的最适反应条件，目的是进一步扩展该种脂肪酶的应用领域。
1 材料与方法1.1 试剂与仪器高效液相色谱仪HP1100，安捷伦公司；褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase，CRL)，Sigma公司；阿魏酸，国药集团公司；阿魏酸乙酯，盐城朗德公司；柠檬酸、磷酸氢二钠，汕头市西陇化工厂。
1.2 方法1.2.1 不同pH值阿魏酸乙酯溶液的配制分别称取阿魏酸乙酯0.0045 g于试剂瓶中，加入20 mL pH值为4.0、6.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，微型漩涡混合仪振荡10 min即得所需溶液。
1.2.2 酶液的制备分别称取一定质量的CRL脂肪酶，加入20 mL 一定pH值的缓冲液，微型漩涡混合仪混合均匀后，4 ℃，10000 r/min离心20 min，于4 ℃下保存，用时取其上清液。
1.2.3 CRL酶活的测定本实验的酶活采用HPLC法来测定，色谱条件：流动相为甲醇:水:冰醋酸=30:69.5:0.5 (V:V:V)，流速8260.9 mL/min，紫外检测器，检测波长318 nm，色谱柱为ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为室温，进样量为20 μL。
取100 mg/mL的酶液250 μL放入EP管中，于一定温度的恒温水浴中保温3 min，然后加入250 μL阿魏酸乙酯溶液，55 ℃温度下精确反应10 min后取出，立即加入250 μL冰乙酸。
在上述色谱条件下进行测定。
以250 μL煮沸失活的酶液为空白样，其它的步骤与上述相同。
酶活定义：在一定温度，一定pH值条件下，每分钟生成1 µmol阿魏酸所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。
酶活力(U/mL)=W×Df×1000 /194.19×10×0.25注：W：酶解反应产生的阿魏酸量(mg)；Df：表示稀释度；1000：将mg转化成µg所乘的系数；194.19：表示阿魏酸的分子量(mg/mmol)；10：反应时间；0.25：与底物反应的待测酶液量。
1.2.4 CRL酶的热稳定性和pH稳定性用不同pH值(3.0~9.0)的缓冲液将CRL酶配制成100 mg/mL的酶液，室温放置24 h，然后回调pH 值至 6.0测定残留酶活。
在测定酶的热稳定性时，将浓度为100 mg/mL的酶液分别放置于不同的温度(20~80 ℃)下60 min，取出后调节温度至55 ℃，然后在此温度下测定酶活。
2 结果与分析2.1 温度对酶活的影响酶对温度的敏感性一般都很强，适当提高反应的温度，可提高酶的活性，有助于反应向正反应方向进行。
另一方面，过高的反应温度，对酶的空间结构影响较大的，使酶活降低并减少酶的使用寿命，促使酶的反应速度不是增大反而减小。
温度对脂肪酶CRL催化反应的影响如图1所示。
图1 温度对酶活的影响Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity由图1可以看出，在较低的温度范围内，随着温度的逐渐升高，反应速度也逐步升高，意味着酶的活性也逐渐升高，当反应温度达到55 ℃时，酶的活性达到了最高值，符合一般动力学规律。
当温度继续升高，催化反应速度又开始降低，酶的活性下降。
由此看出：（1）随着温度的升高，底物分子运动加快，外扩散阻力减少，催化反应速率加快；（2）CRL脂肪酶在以磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为反应体系中的催化反应最适温度为55 ℃。
2.2 pH值对酶活的影响图2 pH值对酶活的影响Fig.2 Effect of pH on enzyme activity如图2所示随着pH值的增加，酶的活性呈先增强后减弱的趋势，当pH值在5.0~6.0时，酶的活性强度随着pH值的增加而增强，当pH值超过6.0后，酶的活性强度随着pH值的增加反而减弱。
有资料显示脂肪酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团[9]，它随着pH值的变化处于不同的解离状态，直接影响了底物的结合和进一步反应，进而影响酶的活性，即pH值的改变将引起酶构象的变化，导致酶的催化活力改变。
因此选择该酶作用的最适pH值为6.0。
2.3 酶浓度对酶活的影响图3 酶浓度对酶活的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on activity如图3显示了酶的添加浓度对酶活的影响，由图可知酶的活性随着酶浓度的增加而增强，但当酶的添加在低浓度范围(酶浓度≤100 mg/mL)时酶活的强度与其成正线性关系，之后随着浓度的继续添加，酶活827828的增长强度趋于平缓，因此该反应的最佳酶添加浓度为100 mg/mL 。
2.4 正交试验对实验结果进行优化本实验采用正交实验来确定CRL 酶的最佳催化条件，正交试验设计是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。
正交试验设计是一种高效率、合是A 2B 2C 3。
综合分析后，得出CRL 催化反应的最适条件为：温度55 ℃，pH 值6.0，酶浓度150 mg/mL ，从经济上考虑酶浓度取100 mg/mL 为最佳。
在此最优的实验条件即温度55 ℃、pH 值6.0、酶浓度100 mg/mL ，进行验证实验，测定获得的该酶活力为39.78 mU ，因此实验获得的最适条件可取。
2.5 酶催化反应的热稳定性2.6 酶催化反应的pH 值稳定性本文通过单因素以及正交试验研究得出CRL 催化反应的最适条件为：温度55 ℃，pH 值6.0，酶浓度100 mg/mL ，并且在此最适条件下进行验证实验，得出100 mg/mL CRL 酶的酶活为39.78 mU ；CRL 酶适合在60 ℃以下温度环境中进行反应，并且适合保藏在pH 值5.0~7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。
参考文献[1]董恒涛,吴晓英,刘仁春,等.假丝酵母脂肪酶催化底物水解的初步研究[J].现代食品科技,2008,24(7): 645-649[2]ChopineauJ, Meeafferty F D, TherisodM, et al. Produetion ofbiosurfactants from sugar aleohols and vegetable oi1s catalyzed by lipases in a nonaqueous media [J]. Biotechnol.Bioengin, 1988, 31: 208-214[3]周瑢,杨继国,王永华,等.一种新型脂肪酶的反应特性及动力学研究[J].现代食品科技,2007, 23(9): 8-13[4]Zhang L Q, Zhang YD, Xu L, et al. Lipase-catalyzedsynthesis of RGD diamide in aqueous water-miseible organic solvents [J]. EnzemeMierob. Teehnol, 2001, 29:129-135 [5]Margolin A L, FitZPatriek P A, Dubin P L, et al.Chemenzymatic synthesis of optieally aetive (meth) acrylie polymers [J]. J. Am. Chem. Soe, 1991, 4693-4693[6]Van Dyck SMO, Lemiere GLF, Jonekers THM, et al. kineticresolution of adiliy drobenzo furan-type neolignan by lipase-catalysed acetylation [J]. Tetralledron: Asymetry, 2001, 12: 785-789[7]Margolin A L. Enzymes in the synthesis of chiral drugs[J].Enzym emierob. Teehnol, 1993, 15: 266-280[8]朱浩,施靠.反相胶束体系中的酶学研究[J].生物化学与生物物理进展,1998,25(3):204-210[9]王元鸿,褚莹,刘景林,等.反胶束体系中脂肪酶催化合成异丁酸异戊酯[J].高等学校化学学报,2004,9:1468-1688829。
