南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造

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酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

面展示脂键词：酵母表面示；南极假丝酵母脂肪酶Ｂ展；全细胞催化；酶争陛质
中图分类号：Ｑ５６５；文献标识码：Ａ：文章篇号：６３９７（０８０．２－４１７．０８２０）７０７６０
ＰｏｅｔｅｆｎｉａａｔｒｔａＬｉａｅＢｓｌｙｄ０ｅＳｒａｅｏｒｐｒｉｓｏＣａｄｄｎａｃｉｐｓＤｉｐａｅｎｔｕｆｃｆｃｈ
ｗｉ－ｉｏｈｎｌｕｙａｂｉｇｏｔｅｓｓｉｂｅｓｂｔａｅＩＷａａｓｏｎｈａｔｅｌａｅａｔｉｏｔｅｙａｍＷａｅｈｃｄｂａｄｔｎｔｐｅｙｂｔｒｔｅｈｐｒｅｎｆｈｍｏｔｕｔｌｓｒｔ．ｔｓｌａｕｏｆｕｄｔｔｈｉｓｃｖｔｆｐｉｙｈｅｓｓｎａｅｙＣ２ａｎｎ
Ｍ，ｕｉｉｉｄｂｂｔｎｂｔｙＣｏｄＣＥｈｅ２ａｎｕ
．
ＫｅｒｓｙａｔｕｆｃｉｌｙＣａｄｄｎａｃｉａＬｐｅＢ，ｏｅｃｌｂｏａａｙｔｐｏｅｔｓｆｎｙｙｗｏｄ：ｅｓｒｅｓａ，ｎｉａａｔｒｔｉａｗｈｌ－ｅｌｉｃｔｌｓ，ｒｐｒｉｅｚｍｅｓａｄｐｃｓｅｏ
黄登峰，潘志友，林影，韩双艳，郑穗平（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州５００１０６）
摘要：本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶ＢＣｎｉａｎａｃｃｐｅ，ＡＢ的—般酶学陛质进行研究，出如下结（ａｄｔｔａｉＣＬ）ｄａｒｉｌａＢｓ得论：酵母表面展示ＣＬＡＢ在碱陛条件下具有很好的稳定性和水解活性。其水解对硝基苯酚酯的最适反应ｐＨ值范围是８８，与游．．５离的ＣＢ商品酶相比，向幽陛条件偏移。最适反应温度范围是４－ＡＬ０４５℃。最适反应底物为对硝基：Ｔｑ酸酯，表现出极为明显的－ｇ￣－ａ底物特异性。Ｃ２、Ｍｇ对其有明显的激活作用。Ｋ对其有微弱的激活作用。而Ｃ２、Ｃ２其有明显的抑制作用。本研究为酵母表ａ＋ｏ＋ｕ＋￣－

11双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶

第37卷第5期2009年5月化　学　工　程CHE M I CAL E NGI N EER I N G (CH I N A ) Vol .37No .5May 2009作者简介:杨建军(1973—),男,工程师,博士生,研究方向为生物催化与生物质转化,E 2mail:mysyjj@;马晓迅(1957—),男,教授,博士生导师,通讯联系人,电话:(029)88302633,E 2mail:maxy m@nwu .edu .cn 。

双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶杨建军,马晓迅(西北大学化工学院,陕西西安　710069)摘要:对南极假丝酵母脂肪酶(CAL )在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG )相对分子质量、NaCl 质量分数和(NH 4)2S O 4质量分数对分配系数K (C AL )的影响,结果表明:温度对K (C AL )影响不大;低相对分子质量PEG 与蛋白质的疏水作用可促进C AL 的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。

在PEG2000/(NH 4)2S O 4双水相体系中,CAL 最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,此时,K (CAL )为8.16,C AL 回收率为91.2%。

关键词:脂肪酶;双水相;分离纯化中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 文章编号:100529954(2009)0520049204Separati on and puri fi cati on of Candida an ta rctica li pasei n aqueous two 2phase syste mYANG J i a n 2jun,M A X i a o 2xun(School of Che m ical Engineering,North west University,Xi ′an 710069,Shaanxi Pr ovince,China )Abstract:The partiti on behavi or of Candida an tarctica li pase (CAL )in aqueous t w o 2phase syste m (ATPS )was investigated .The effects of te mperature,relative molecular mass of polyethylene glycol (PEG ),the mass fracti onof NaCl and (NH 4)2S O 4on partiti on coefficient of CAL K (CAL )were studied .The results show that in ATPS,te mperature was uni m portant for partiti on coefficient of CAL K (CAL ),while the electric potential difference bet w een t op and bott om phase was i m portant .It was als o discovered that the less the molecule mass of PEG was,the more favorable conditi ons f or the CAL congregati on int o the phase because of the increased hydr ophobicity for med .A t the r oom te mperature,the op ti m ized extracti on conditi ons were as foll ows:mass fracti on 20%PEG 2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,and K (CAL )was 8.16,the recovery rate of CAL was 91.2%.Key words:li pase;ATPS;purificati on 固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油已成为近年来新能源研究的热点之一。

阿魏酸及其衍生物的合成及药效研究进展

阿魏酸及其衍生物的合成及药效研究进展摘要：阿魏酸具有良好的药效作用，在医药及化妆品等行业被广泛应用。

阿魏酸的获取主要通过植物提取和化学合成两种途径，由于天然资源有限，故化学合成成为主流。

对阿魏酸及其衍生物的合成以及药效研究进展作了综述。

关键词：阿魏酸；阿魏酸衍生物；合成；药效阿魏酸(Ferulic Acid，FA)是当归、川芎等活血化瘀中药材活性成分之一，在其它植物中也分布广泛。

由于其具有良好药效的作用，在医药及化妆品等行业被广泛应用。

特别是近几年在药理学方面广泛而又深入的研究，发现了许多的阿魏酸及其衍生物的生物活性[1，2]，激发了人们对阿魏酸及其衍生物的研究兴趣。

在合成方面，主要化学合成方法研究和生物催化合成方法研究。

在药效方面的研究主要是心血管方面和作为自由基淬灭剂和抗氧化性，在抗衰老方面的研究。

1 阿魏酸的合成及药效学研究目前阿魏酸主要通过两种途径获得。

一是从植物中分离，比如从当归、川芎中、酸枣仁[3]中分离。

但由于天然资源的有限性，很难满足对阿魏酸日益扩大的需求。

故通过合成途径获得阿魏酸的研究较为活跃。

日本研究人员通过碱性条件下水解生产色拉油过程中产生的废料获得阿魏酸，取得较好的经济效益[4]。

通过化学合成获得阿魏酸的方法较为成熟。

主要是以香草醛和丙二酸为原料来制备。

不同方法的区别主要是所选用催化剂的不同和是否设法除去反应中生成的水[5～7]。

其中张相年等人采取的以哌啶作为催化剂和以苯作为除水剂使阿魏酸的收率达98%以上，纯度达到99.4%，更适宜工业化生产。

由于生物催化合成具有清洁高效耗能低的独特优势，符合合成化学发展的趋势，故阿魏酸的生物催化合成受到重视，有用微生物将丁子香酚肉桂酸酯转化为阿魏酸的报道[8]。

但尚未有用微生物工业化生产阿魏酸的报道，仍需进行大量而深入的研究以获得突破。

2 阿魏酸衍生物的合成及其药效研究阿魏酸化学名4-羟基-3甲氧基苯丙稀酸，是一种酚酸。

尽管阿魏酸在某些方面具有确切的药理活性，但其分子中含有双键，烷烃基较短，易亲水，很难透过生物膜脂质双分子层。

南极假丝酵母产脂肪酶在15L发酵罐中培养条件的研究

化学与生物工程2007,Vol.24No.7　Chemistry &Bioengineering43　基金项目:滨州医学院科研启动基金项目(B Y2005KYQD28)收稿日期:2007-03-15作者简介:李燕妮(1980-),女,山西临汾人,硕士,助教,主要从事发酵工程研究。

E 2mail :lyn0158@ 。

南极假丝酵母产脂肪酶在15L 发酵罐中培养条件的研究李燕妮1,衣婷婷2,李龙森1(1.滨州医学院基础学院,山东烟台264005;21山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘　要:对15L 发酵罐中南极假丝酵母(C 1antarctica DSM3855)的发酵工艺条件进行了研究,确定了最适的产酶工艺条件:搅拌速度为300r ・min -1,通气量为10L ・min -1,接种量为10%,添加GPE 作为消泡剂。

在此培养条件下,培养54h 产酶达到高峰值,最高酶活力达到1913U ・mL -1。

关键词:发酵;南极假丝酵母;发酵罐中图分类号:Q 932335 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)07-0043-02 南极假丝酵母产脂肪酶是一种重要的脂肪酶,具有许多优良的特性,对相当广泛的底物显示出很高的对映选择性,因此在有机合成、制药、医药中间体等领域得到广泛应用[1～3]。

目前,生产脂肪酶的培养基成本较高,发酵周期长,使南极假丝酵母产脂肪酶生产成本较高。

作者采用了廉价的培养基进行大罐发酵,可以很大程度上降低成本。

1　实验111　菌种和培养基南极假丝酵母C.ant arctica DSM3855(本实验室保存)。

斜面培养基、液体种子培养基、发酵培养基[4]。

112　方法11211　工艺流程保藏菌种→斜面活化→平皿培养→种子液摇瓶培养→15L 发酵罐培养11212　种子培养从新鲜斜面上取两环菌C.ant arctica ,接种到25mL (250mL 的三角瓶)种子培养基中,24℃下回转式摇床200r ・min -1振荡培养16h ,制成种子液。

生物催化论文

利用介孔硅酸盐对南极假丝酵母中脂肪酶B的化学修饰和固定化摘要：对南极假丝酵母（CalB）中的脂肪酶B进行化学修饰并将其固定在三种不同的介孔硅酸盐（MPS ）中，用两种双功能试剂EGNHS和戊二醛以及单一功能的柠康酸酐对可溶性的CalB进行修饰。

经过化学修饰和未经处理的酶均通过吸附固定在SBA-15, CNS和MCM型介孔硅酸盐上，并对经过溶解和固定化预处理的化学修饰的CalB进行热稳定性评价和比较。

结果表明，在70C条件下，柠康酸酐明显地降低了CalB的热稳定性，而与自然状态下游离的CalB相比，两种双功能性的试剂都将它的热稳定性提高了8倍。

经EGNHS处理过的CalB接着固定在CNS-MPS上，其稳定性提高了六十几倍，同时，这种方法的结合被证明是最有效的能提高稳定性的方法。

CalB也更易吸附在孔径更大的SBA-15型MPS上，而且CalB经藻酸盐固定后热稳定性也比较好。

1.前言脂肪酶属于水解酶类，催化由甘油和长链脂肪酸形成的酯类的水解。

它们也水解其他类型的底物，然而，它们能够催化底物进行酯化反应和转酯化反应，这些功能使脂肪酶在生物技术工业领域得到广泛应用，比如在对映体纯的药品和精细化学品的合成、乳制品产业、石油加工及化合物和食品的调味料加工这些方面的应用。

研究发现，脂肪酶在动物、植物、真菌和细菌中广泛存在。

CalB是从南极假丝酵母中分离出来的一种非常有研究价值的酶，也许在工业上是脂肪酶中最重要的一个，因为它能够催化多种多样的反应、不溶于有机溶剂、适当的热稳定性、立体定向性和高度的对映选择性。

Uppenberg等人测定了CalB的X射线晶体结构，发现该酶由317个氨基酸组成，分子质量大约为33kDa，等电点为6.0。

与其他脂肪酶相比，CalB只有一个小的活性位点盖子，所以它的活性位点暴露于溶剂中。

对一些特定的底物，它不会表现出一个脂肪酶所具有的典型的界面活性。

这些性质使它能催化进行相当多的反应。

脂肪酶

脂肪酶催化药物合成院系：化工学院班级： 2009级制药工程2班学号： 20009650818姓名：李红霞脂肪酶催化药物合成摘要：将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分等研究。

常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。

从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。

关键词：脂肪酶；酶催化；手性拆分；药物合成；应用一、综述脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。

在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。

脂肪酶结构有2个特点：(1) 脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser- W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；(2) 活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护。

脂肪酶的特性脂肪酶底物专一性酶的底物专一性取决于酶分子结构，脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成。

活性中心靠近分子疏水端。

不同来源的脂肪酶存在着结构上的差异，使得不同的来源的脂肪酶有不同的底物专一性。

1.1来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

低共熔溶剂制备及应用的研究进展

低共熔溶剂制备及应用的研究进展韦少辉，杨世平，蒙启洋，詹阿慧，李坚斌*（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）摘要：低共熔溶剂（DESs ）是一种新型溶剂，遵循绿色化学原理制备，具有低毒性、可持续性、可生物降解性、可回收利用等优点，制备方法简单，成本低，具有替代传统有机提取溶剂的潜能。

其中，基于天然特质如有机酸、氨基酸或糖所制备的DESs 具有丰富的化学多样性，这使得DESs 在食品加工和制药等领域有着绝对优势，并已得到广泛应用。

文章归纳总结了DESs 制备的技术方法（加热制备方法、研磨制备方法、旋转蒸发制备方法和冷冻干燥制备方法），并探讨了DESs 在溶解分离、催化以及材料制备领域的应用，总结其理化特性和目前DESs 应用发展所面临的主要问题，并展望DESs 在各种工业应用中的前景和未来研究方向。

关键词：低共熔溶剂（DESs ）；制备；溶解；分离；催化中图分类号：TQ413文献标志码：A文章编号：2095-820X （2023）05-0019-05收稿日期：2023-08-02基金项目：“十四五”广西糖料蔗科技重大专项（桂科AA22117014）；广西大学自治区级大学生创新创业训练计划项目（S202210593361）通讯作者：李坚斌（1970-），女，博士，主要从事糖类物质生物利用及结构修饰研究工作，E-mail ：****************第一作者：韦少辉（2000-），男，研究方向为甘蔗制糖，E-mail ：*****************0引言低共熔溶剂（DESs ）是一种对环境友好的溶剂，有其独特的化学性质和特点。

DESs 是通过混合2种或3种氢键受体（HBA ）和氢键供体（HBD ），并按照特定的摩尔比进行组合而成。

这类溶剂的凝固点显著低于各物质纯组分的熔点，这是由于共晶体或低共熔分子的形成使原单组分分子的晶格发生畸变，晶格能下降，造成熔点下降，在室温下呈现液体状态［1］。

脂肪酶催化药物合成的研究进展

脂肪酶催化药物合成的研究进展熊小龙;杜鹏飞;金鹏;王秋岩;谢恬【摘要】脂肪酶是工业中常用的生物催化剂,由于其催化的反应类型多样、反应条件温和、催化效率高、具备良好的区域和立体选择性,被广泛应用于药物合成领域.为了跟踪掌握脂肪酶在药物合成领域的最新进展,综述了近5年来脂肪酶在催化合成抗炎镇痛药物、抗抑郁药物、抗菌药物、抗肿瘤药物、维生素类药物及其中间体方面的最新应用,对新构建的工艺实例中脂肪酶的性质和优化的反应条件进行了重点描述.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)008【总页数】8页(P1-7,23)【关键词】酶法催化;脂肪酶;药物合成;手性中间体【作者】熊小龙;杜鹏飞;金鹏;王秋岩;谢恬【作者单位】杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江,杭州,310036;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江,杭州,310036;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012;杭州师范大学生物医药与健康研究中心,浙江,杭州,310012【正文语种】中文【中图分类】Q556脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)可以水解三酸甘油酯产生脂肪酸、单甘油酯、双甘油酯及甘油，在有机溶剂(包括超临界流体)中，亦可催化逆水解反应，例如酯化、交酯化、氨解、交流酯化及肽解等反应。

脂肪酶已广泛应用于食品、造纸、皮革、洗涤剂、化工材料和医药合成等诸多领域，其中，药物合成一直是脂肪酶研究领域的热点。

目前，临床上超过60%的常用药物为手性药物。

通常的化学工艺对手性分子的合成并不理想，存在反应路径长、重金属催化剂残留和收率低等缺点；而脂肪酶对底物具有高度的立体选择性，只需单步反应就可以高效率地制备出手性产物，这使得脂肪酶在光学纯化合物制备和药物手性转换中具有独特的优势。

脂肪酶的综述

食品与药品 Food and Drug 2007年第 9 卷第 12期脂肪酶的研究进展张中义，吴新侠（郑州轻工业学院食品与生物工程系，河南郑州 450002）摘要：对脂肪酶菌种来源、催化活性中心构成对酶活性的影响及工业应用的研究进展作一综述。

关键词：脂肪酶；催化作用；应用中图分类号：Q 55 文献标识码： A 文章编号：1672-979X(2007)12-0054-031前景与展望脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。

固定化脂肪酶可重复利用，提高酶稳定性、有利于实现工业化生产，降低生产成本。

目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化还有相当大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作深入研究。

今后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领的研究人员通力合作，筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。

2 脂肪酶结构和分子生物学研究2.1 脂肪酶的结构脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。

脂肪酶结构有 2 个特点：（1）脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、W、Z 是可变的氨基酸残基）；（2）活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受 1个α-螺盖保护；（3）多数脂肪酶都有 1 个螺旋片段，一般称为“盖子”,当酶处于闭合状态时，活性位点被“盖子”覆盖。

当存在脂质微囊时，“盖子”打开与其结合，催化脂肪水解。

Secundo[4]研3种脂肪酶是：柱状假丝酵母脂肪酶(Candida rugosalipase, CRL),莓实假单胞菌脂肪(Pseudomonasfragilipase,PFL)和枯草杆菌脂肪酶A(Bacillussubtilisli-pase A, BSLA)。

用 CRL同工酶 3 代替 CRL 同工酶 1的盖子结构时，脂肪酶在有机溶剂中的活性和立体选择性都有降低。

假丝酵母99-125发酵生产脂肪酶工艺研究

ｔｉｌａｔｏｒｙｃａｐａｃｉｔｙｗａｓ０．８：１，ｓｐｅｅｄｏｆａｇｉｔａｔｏｒｗａｓ１２２ｒｐｍ／ｍｉｎ．Ａｔｌａｔｅｒｐｅｒｉｏｄｏｆｆｅｒｍｅｎｔａ — ｔｉｏｎ，ａｄｄｉｎｇ０．５９／６ｓｏｙｂｅａｎｏｉｌｐｒｏｍｏｔｅｌｉｐａｓｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｔｈｅｆｉｎａｌｌｉｐａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ７２４０Ｕ／ｍＬａｔ１０３ｈ；Ｕｓｅｄ３ｓｏｙｂｅａｎｉｓｏｌａｔｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ２ｓｏｙｂｅａｎｂｉｏ — ｎｕｔｒｉｅｎｔａｓｎｉｔｒｏｇｅｎ
ＢｅｉｊｉｎｇＣＴＡＮｅｗＣｅｎｔｕｒｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１７６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＬｉｐａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｗｉｔｈｃａｎｄｉｄａｓｐ．９９— １２５ｗａｓｉｎ — ｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｓｔｅａｄｉｌｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｉｐａｓｅｉｎ５ｍ。ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｍａｋｅｓｕｒｅｔｈｅｂｅｓｔｖｅｎ —

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基因组学与应用生物学，2011年，第30卷，第2期，第243－250页Genomics and Applied Biology,2011,Vol.30,No.2,243－250评述与展望Review and Progress南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造章素平柳志强郑裕国*浙江工业大学生物工程研究所,杭州,310014*通讯作者,zhengyg@摘要南极假丝酵母脂肪酶B是用途最为广泛的脂肪酶之一，可用于许多有机化合物、医药中间体等的合成。

为了改善南极假丝酵母脂肪酶B的催化性能，提高其环境适应性，同时提高蛋白的表达量，降低生产成本，从而使其更适于工业化应用，许多针对酶蛋白分子的修饰及改造方法已在南极假丝酵母脂肪酶B中得到大量应用。

本文从化学修饰、理性设计和非理性设计3个方面详细综述了南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造的关键技术，包括定点突变、蛋白质融合、易错PCR和DNA改组等，同时也介绍了以上技术在改良南极假丝酵母脂肪酶B特性方面的诸多成功实例。

关键词南极假丝酵母脂肪酶B,化学修饰,理性设计,非理性设计Research Progress of Modification for Candida antarctica Lipase BZhang Suping Liu Zhiqiang Zheng Yuguo*Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou,310014*Corresponding author,zhengyg@DOI:10.3969/gab.030.000243Abstract Candida antarctica lipase B is one of the most widely used lipases,which has been used for the synthe-sis of many organic compounds,and pharmaceutical intermediates.In order to improve the catalytic properties of Candida antarctica lipase B,enhance its environmental adaptability for industrial applications,increase its yield and reduce production costs,many modified methods have been widely applied.This paper elaborates on the tech-nologies for modification of Candida antarctica lipase B from three aspects:Chemical modification,rational de-sign and irrational design,such as site-directed mutagenesis,protein fusion,error-prone PCR,DNA shuffling,and then presents their application and achievements in improving the properties of Candida antarctica lipase B. Keywords Candida antarctica lipase B,Chemical modification,Rational design,Irrational design脂肪酶(1ipase,EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯(Jaeger et al.,1994;Joseph et al.,2008)。

脂肪酶通常被用于在非水相体系中催化油脂及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成等反应(Rufinoa et al.,2010;Rejasse et al., 2003;Yang et al.,2009)。

由于其高效专一、反应条件温和等特点，已有越来越多的脂肪酶在油脂加工、造纸、食品、医药和日化等行业中得到应用(Hasan et al., 2006;Salameh and Wiegel,2007)。

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在脂质代谢中发挥着重要的作用。

由于微生物具有种类多、生长繁殖快及易发生遗传变异的特点，微生物源脂肪酶比动、植物源脂肪酶的性质更具多样性(如更广的作用pH范围、作用温度范围以及作用底物多样性等)，更加适合于工业化生产。

因此，微生物是工业用脂肪酶的重要来源(Hasan et al.,2006;Salameh and Wiegel,2007)。

其中，南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctic lipase B,CALB)应用最为广泛，它对水溶性和非水溶性物质都表现出较高的催化活性。

目前，对CALB的研究较为透彻，包括其氨基酸序列、立体三维结构和催化机理等都已获得解析，同时该酶的基因也已成功实现了克隆表达。

但是，天然的CALB仍存在一定的缺陷，如热稳定性较差、产量较低等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，因此，为改善CALB相应的酶学特性，提升催化能力，提高其反应稳定性，研究人员采用蛋白质工程手段，基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology对CALB进行修饰与改造，以获得更适应工业生产条件的生物催化剂。

本文详细介绍了CALB的修饰与改造的研究进展及其相关应用。

1CALB的简介人们通常从极端环境中筛选具有极端性质(如耐高、低温,高、低pH,高盐浓度,高压力,高辐射等)的生物催化剂，南极假丝酵母(Candida antarctic)就是从南极洲样品中筛选到的一株具有特殊性质的酵母菌，它可以产生2种性质完全不同的脂肪酶，分别为脂肪酶A(Candida antarctic lipase A,CALA)和脂肪酶B(CALB)(Kirk and Christensen,2002)。

与CALA 相比，CALB的分子量小，热稳定性较差，蛋白等电点较低(pI=6.0)(Patkar et al.,1993)，但CALB的催化活性更高，在生物催化过程中所需酶量远远少于CALA(de Maria et al.,2005)，因此，截至目前，CALB 的应用更为广泛，且已经由诺维信公司作为产品(Novozymes435)实现商业化生产。

1994年，Uppenberg 等(1994a;1994b)人测定出CALB的氨基酸序列及其三维立体结构，如图1所示。

CALB由317个氨基酸残基组成，分子量为33kD，与其它脂肪酶的氨基酸序列对比发现它们之间没有明显的同源性。

CALB 的结构是一典型的α/β水解酶类似折叠，活性位点位于蛋白结构的中心，由催化三联体Serl05－Asp187－His224、1个氧负离子洞及1个特异性底物结合口袋构成。

在CALB的活性位点附近具有一段保守序列Thr-x-Ser-x-Gly，与大多数脂肪酶不同的是CALB活性中心没并有被螺旋片断(又称为“盖子”)埋藏，因此，CALB无界面活性(Martinelle and Hult,1995;Rottic ci-Mulder,2003)。

CALB是一种丝氨酸水解酶，它的催化机理是双乒乓机制(Martinelle and Hult,1995;Ottosson,2000)，该机制可以分为酰化和去酰化两步。

第一步，底物S1作为酰基供体进入酶的活性位点形成不稳定的中间体CALB-S1，继而释放出产物P1形成酰化CALB'；第二步，底物S2作为亲核试剂进入活性位点使CALB'去酰化，并生成产物P2，同时CALB恢复为自由态(图2)。

其中，可以与CALB反应的酰基供体很多，譬如酸、酯、硫酯和碳酸盐等。

而第二步中的亲核试剂也有多种，包括醇、氨基酸和半缩醛等。

为了研究CALB的性质及提高产量，自1995年以来，CALB实现了在不同宿主中的克隆表达，如：米曲霉(Aspergillus oryzae)(H覬egh et al.,1995)、毕赤酵母(Pichia pastoris)(Rotticci-Mulder et al.,2001)、酿图2CALB的催化机理Figure2The catalysis mechanism of CALB酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Han et al.,2009)和大肠杆菌(Escherichia coli)(Rotticci-Mulder,2003)等。

CALB的克隆、表达为其修饰与改造奠定了良好的基础。

总之，CALB具有非常广阔的底物谱，无论在酶学理论研究还是实际工业应用中，它都是一种广泛应用的生物催化剂。

因此，在清楚CALB分子结构及催化机理的基础上，对CALB进行修饰与改造具有一定的理论和现实意义。

蛋白质工程指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过对蛋白本身和其基因进行有目的地修饰和合成，对现有蛋白质进行定向设计和改造以构建新型蛋白质的过程(刘仲敏等,2004)。

酶分子水平上的修饰与改造都是蛋白质工程研究的范畴。

随着人们对蛋白质改造能力的增强，以及CALB 应用的广泛性，关于修饰和改造CALB以适应特定的工业催化过程的研究逐渐成为热点。

目前，对CALB的修饰与改造可以归纳为3个方面：一是利用化学物质对酶分子的自由氨基酸残基进行修饰和改造，即化学修饰；二是基于已知序列和结构的理性设计；三是利用基因的可操作性，模拟自然界演化进程的非理性设计(孙志浩,2005)。

2CALB的化学修饰蛋白质分子的完整空间结构决定其生物催化剂图1CALB的三维立体结构(PDB ID:1TCA)Figure1The3D structure of CALB(PDB ID:1TCA)244的功能，通过引入或去除部分化学基团，使蛋白质分子共价结构发生改变的过程称为蛋白质的化学修饰。

用化学修饰的方法研究蛋白质的结构与功能是一种重要的基础手段，通过对蛋白质侧链基团的修饰，可探测蛋白质活性部位的结构，推测被修饰残基在该蛋白质分子中的作用，为蛋白质改造提供依据(刘仲敏等,2004)。

经过改造后的蛋白质在结构上发生了某些变化，从而在其功能和性质上出现相应的改变，适宜的化学修饰能够使酶蛋白向着更有利于工业化应用的方向发展。