皱褶假丝酵母脂肪酶

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微生物发酵生产脂肪酶的研究进展

关键词：脂肪酶；微生物；发酵
一、什么是脂肪酶以及脂肪酶如何生产（１）脂肪酶学名是三酰基甘油酰基水解酶，能够催化油脂发生水解反应，生成脂肪酸和甘油等物质。脂肪酶是酶类的一种，其本质是由氨基酸组成的蛋白质物质，由于脂肪酶有专一性，所以只对一种脂肪起作用，不同结构的脂肪酶其可以发生作用的油脂类物质也不同。脂肪酶最早于１８３４年被发现，是生物体内极其重要的代谢酶，是人体和生物体代谢过程中不可缺少的酶类。有了脂肪酶，人体和生物体摄入的油脂类物质才能被肠道吸收。随着时代的发展，脂肪酶也逐渐被应用在工业上。（２）通常情况下我们会利用的脂肪酶主要来源于微生物的发酵。产脂肪酶的菌类主要有黑曲霉菌、荧光假单胞菌、白地霉无根根霉菌、毛霉圆柱假丝酵母菌、巢子须霉德氏根霉菌、多球菌绵毛状腐质霉菌、圆弧青霉黏质色杆菌。而国内用于生产提取脂肪酶的菌种以黑曲霉为主，采用液体深层发酵的方法。脂肪酶发酵菌还用于工业生产，其产量和产酶质量必然是各大生产厂家最关注的问题。因此科研人员采用诱变技术对脂肪酶不断作用引起其基因突变并且一步一步进行筛选，最终得出可以用于工业生产的高产菌株。高产菌株的产酶能力是一般菌株的几十倍甚至上百倍。富集培养基用于增加所采集样本中微生物的数量，以避免把某些微生物漏掉，所以通常用全营养培养基。初筛培养基用于把不产目标产物的微生物去掉，把产生目标产物的微生物挑选出来，所以一般要用目标产物的底物作该类物质的唯一来源。例如，如果筛选产纤维素酶的微生物，就在初筛时，用纤维素作唯一碳源；如果筛选产菊糖酶的微生物，就用菊粉为唯一碳源。这样一来，不能产生目标产物的微生物就无法生长，而能够生长的一定是能够产生目标产物的微生物。复筛培养基的作用是挑选出高产菌株，有时，还附带确定初步的产物产生条件。仍以纤维素酶产生菌为例，培养基用纤维素为唯一碳源，制平板，微生物生长后，看透明圈，直径越大，产生的酶就越多（或酶活力越高）。挑选出高产菌株，用液体培养，取样测酶活力，再次挑选出高产菌株。用正交试验初步确定产酶条件。基本上一支菌种就这样筛选出来了。当然，实际情况可能复杂得多，如筛选不到想要的微生物、产物存在，但活性太低，没有实用价值等等。反正若是想得到一支好的微生物菌种着实不易。二、如何提高脂肪酶的产量（１）我们都知道，脂肪酶是一种活性很大的物质，而其生物分类属于蛋白质类有机物。因此，我们可以通过对比蛋白质类似物质来发现如何提高脂肪酶的产量。通过研究发现脂肪酶的活性主要是受到脂肪酶所处的具体环境影响，如温度等因素，所以我们可以通过观察酶的所处的环境来确定脂肪酶的活性是否受其影响。除此之外，在使用微生物生产脂肪酶的过程

假丝酵母99-125脂肪酶喷雾干燥工艺及催化性质的研究

ＡｂｓｒｔＴｈｒｃｓｏｄｔｏｏｐａｒｉｇｏｎｉａｓ９～１５ｉａｅｗａｐｉｚｄｂｅｔａｃ：ｅｐｏｅｓｃｎｉｎｆｒｓｒｙｄｙｎｆＣａｄｄｐ．９ｉ２ｌｓｓｏｔｐｍｉｅｙａｒ —
ＰＡＮｅ，ＴＡＮａｗｅＸｕＴｉｎ— ｉ
（ｅｉｅａｏａｒｏＢｏｒｃｓ，ｏｅｅｏｉｃｎｅａｄＴｃｎｌｇ，ｅｉｎｖｒｔｏＣｅｉｌＢｉｎＫｙＬｂｒｏｆｉｏｅｓＣｌｇｆｆＳｉｃｎｅｈｏｙＢｉｎＵｉｓｙｆｈｍｃｊｇｔｙｐｌＬｅｅｏｊｇｅｉａＴｃｎｌｇ，ｅｉｇ１０２，ｈｎ）ｅｈｏｙＢｉｎ００９Ｃｉｏｊａ
肪酶活力收率的影响。确定了最佳啧雾条件：护剂为１保０～ｌＬ的阿拉伯胶，口温度ｌ５～１０ｏ雾化速度５进１２Ｃ，０４Ｌｈ可得到收率最高为６．％的脂肪酶酶粉。制得的固定化酶用于手性拆分（，）一乙醇，学产率最．／，０５Ｓ一１苯光高可达到５．％；于催化合成生物柴油，３６用转化率最高可达到９．％。在４３ ℃ 下密封保存，衰期可分别达到０２、Ｏ半
第８卷第２期２１００年３月
生
物
加
工
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ＶｏＮｏ．Ｌ８２

脂肪酶

来源：
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物：含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽动物：含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织。细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的发酵微生物有黑曲霉，假丝酵母等等。适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，一般不同来源的脂肪酶特性也不一样并且在理论研究方面也具有重要的意义。
应用：
1.用于合成结构化甘油三酯
2.脂肪酶在乳品工业中的应用 3.脂肪酶在日化制品中的使用 4.脂肪酶在脂肪酸化学中的应用
脂肪酶在乳品工业中的应用
应用于乳醋水解, 包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶伟品的生产、奶油及冰激凌的醋解改性等。脂肪酶作用于乳醋产生脂肪酸, 能赋予奶制品独特的风味。脂肪酶释放的短碳链脂肪酸，使产品具有一种独特强烈的奶风味, 而释放的中碳链脂肪酸。一使产品具有皂似的风味。传统奶酪制品加工所用的脂肪酶大都来自动物组织, 如猪牛的胰腺和年幼反自动物的消化道组织。不同来源的脂肪酶会产生不同风味特征。脂肪酶还使用在羊奶仿造牛奶的制品中。对不同奶源的奶制品, 脂肪酶的使用大大改善其原有的不良风味, 促使新的风味产生, 并能改进乳制品的营养价值。在生产酶改性奶酪制品中脂肪酶起关键作用 ,酶改性奶酪中的游离脂肪酸比只经过普通处理的奶酪中要高倍以上, 这对于其作为风味增强剂是十分有利的。
脂肪酶在日化制品中的使用
这个市场可谓是脂肪酶工业应用中最大的方面首先是在洗涤剂中的添加, 目前脂肪酶的使用不很广泛, 主要原因是在碱性洗涤条件下稳定的脂肪酶还较少, 而碱性洗涤是目前的盛行的方式。如今众多中性洗涤剂中都以添加蛋白酶和脂肪酶来改善其洗涤特性, 在高档洗涤剂领域应用脂肪酶的前景最为可观。脂肪酶在这方面大有作为。

假丝酵母脂肪酶催化底物水解的初步研究

氏常数Ｋ为１．ｘ０ｍ２２１０ｍｏＬ５ｌ，最大反应速率Ｖｘ为ｌ．ｔｌｎ／ｍａ１１ｍｏｍｉ。４￣／
关键词：脂肪酶；粗状假丝酵母；水解中图分类号：Ｑ５６５；文献标识码：Ａ；文章篇号：６３９７（０８０．６５０１７．０８２０）７０４．５
（ｌｇｆｏｃｅｃｎｏｎｉｅｒｇＳｕｈＣｈｎｉｅｓｙｏＴｃｎｌｇ，ａｇｈｕ５０４，ｈｎ）ＣｏｌｅｏＢｉｓｉｎｅａｄＢｉｅｇｎｅｎ，ｏｔｉａＵｎｖｒｉｆｅｈｏｏｙＧｕｎｚｏ１６０Ｃｉａｅｉｔ
ｈｄｌｓｍｅ２ｈｏｌｔｔ／０ｅｌｆｉｇａｅｔｏｔｔｆｏｏａｄＣ２ｃｎｅｔｔｎｏ５ｍｍｏＬＴｅｅｚｍｅｋｅｃｙｒｙｉｔ１，ｉｅｒｉ１，ｍｕｓｙｎｇｎｎｎ／ｉｎａ＋ｏｃｎｒｏｆ７ｏｓｉ／ｒａｏ１ｗａｉｃｅｏ４ｑｌ）ａｉｌ，ｈｎｙｉｔｓ／ｎｉ
脂肪酶（ｐｓ，Ｅ３１．，甘油酯水解酶），是１ａｅＣ．．３ｉ１
一
类特殊的酯键水解酶，主要水解由甘油和ｌ个碳原２
１材料与方法
子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油酯。不同来源的脂肪酶，其结构的差异使它们对不同底物的特异性也不同Ｌ。ｌ利用脂肪酶催化天然底物油脂水解的特性可】
（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州５０４）１６０
摘要：了粗状假丝酵母诱变株ｚ６产脂肪酶水解不同底物的相对酶活，包括对低级酯，脂肪酸甘油酯和天然油脂的水解。并对粗状假丝酵母ｚ产脂肪酶催化水解玉米油和大豆油反应中的ｐ６Ｈ值、温度、时间、油／水比、

皱褶假丝酵母脂肪酶催化合成VE阿魏酸酯的研究

（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＫａｉｈｏｎｇＦｌａｖｏｒ＆ＦａｇｒｒａｎｃｅＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａｌｉｐｓｅａ（ＣＲＬ）ｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＥａｎｄｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｔｏｓｙｎ协ｅｓｉ２ｅ
（广州市凯虹香精香料有限公司，广东广州５１０５５０）
摘要：本文研究了反胶束体系中利用褶皱假丝酵母脂肪酶催化维生素Ｅ和阿魏酸乙酯合成维生素Ｅ阿魏酸酯的反应通过单因
素试验利用褶皱假丝酵母脂肪酶在Ａ０Ｔ．异辛烷．水反胶束体系中催化阿魏酸乙酯和维生素Ｅ反应１３６ｈ生成ｖＦ阿魏酸酯，并研究了含水率、转速、温度、缓冲液ｐＨ值、ＡＯＴ的浓度等反应条件对ｖＥ阿魏酸酯合成的影响。通过均匀设计法设计实验，并对结果进行二次多项式逐步回归分析，得到一组最优合成的反应条件，即含水率１０、ＡＯＴ浓度８０ｍｍｏｌ／Ｌ、缓冲液ｐＨ值５．０、温度２５ ℃、转
ｃｏｎｄｉｉｏｔｎｓｏｆｓｎｔｙｈｅｉｃｐｔｒｏｄｕｃｔｗｅｒｅｇａｉｎｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｍｏｉｓｔｕｒｅｃｏｎｔｎｔｅ１０％，ＡＯＴｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ８０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｔｈｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

微生物脂肪酶的纯化方法概述

微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。

脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。

本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。

关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。

同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。

1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。

研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。

其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。

与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。

脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。

在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。

此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。

1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。

脂肪酶的应用

•
脂肪酶的应用脂肪酶应用十分广泛，主要应用
于皮革、食品、医药、生物能源和洗涤剂等许多工业领域中。其应用的现状及前景可以归纳为:(l)脂肪酶广泛用于开发新型的生化转移反应器，以固定化酶反应器为主，目前已有上百种关于采用脂肪酶的生化反应器的报道。(2) 脂肪酶的使用的和建议使用的工业用途将大大超过糖酶和蛋白酶。随着研究的不断深入，脂肪酶的工业应用的范围将不断扩大。
脂肪酶的应用
马媛何茹
脂肪酶简介
• 脂肪酶(LIPase，EC3.1.1.3)即三酞基甘油酞基水解酶，是一类重要的甘油酷键水解酶，它可以在油水界面上催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和中间产物甘油单酩或二酷。其催化反应如下:
•ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
其中的二脂酞甘油可被进一步水解为单脂酞甘油、甘油和游离脂肪酸。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，脂肪酶的不同活性的发挥取决于反应体系的特点，如在油水界面促进酷水解，但在有机相中就可以酶促合成和进行酷交换。
5.造纸工业中的应用
树脂的主要成分为三脂酞甘油和蜡，脂肪酶在造纸工业中用于去除纸浆中的树脂，从而减弱因为树脂在干燥柱上沉积对造纸质量造成的影响。因为亚麻酸、亚油酸和油酸等高级脂肪酸的三脂酞甘油包含在油墨中，所以纤维素酶和脂肪酶联合使用可以用于去除废纸中的油墨。为提高造纸质量，日本的Nippon纸业采用皱褶假丝酵母所产生的脂肪酶水解树脂，可去除高达90%的三脂酞甘油。
2.制革方面的应用
残余蛋白质和脂肪的脱除是皮革加工过程中一个重要的步骤。目前常用的脱脂方法主要有三种:乳化法脱脂、皂化法脱脂和溶剂法脱脂。但这三种方法都存在去脂程度不理想、劳动强度大和严重污染环境等缺点。因此用酶制剂产品替代化工原料用于皮革加工是一种既清洁又环保的新型工艺。在皮毛、绢纺、明胶、皮革等的脱脂方面，脂肪酶都取得了良好的脱脂效果。解脂假丝酵母的脂肪酶可以在不影响纤维强度的情况下，为达到纺丝要求，而使绢纺原料10%的油脂含量降为0.5%，除此之外脂肪酶还能用于皮毛脱脂和去除皮革胶原纤维之间的脂肪，不仅使皮毛产品柔软、弹性好，而且还具有不影响皮革牢度和厚度的优点。

211025952_脂肪酶的固定化及其在药物合成中的应用进展

生物技术进展 2023 年第 13 卷第 2 期 220 ~ 227Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews脂肪酶的固定化及其在药物合成中的应用进展周亚梅，刘佳，陆丹，孔庆新 *重庆化工职业学院制药工程学院，重庆 401228摘要：脂肪酶是一种常用的生物催化剂，被广泛应用于医药、食品、生物化工等领域。

但游离脂肪酶稳定性差，易受所处的环境影响，重复使用性差，限制了酶催化工业的应用。

针对游离脂肪酶在催化领域的不足，酶固定化技术应运而生。

脂肪酶经固定后大大提高了其原有的催化活性和稳定性，利用固定化脂肪酶自身的优良性能选择性催化合成所需产物，反应条件温和、收率高、副反应少，工业应用更加广泛。

综述了脂肪酶固定化及其在药物合成中的研究和应用进展，并对固定脂肪酶的前景进行了展望，以期对固定化脂肪酶在工业中的应用提供一定参考。

关键词：脂肪酶；固定化；催化；药物合成DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2022.0207中图分类号：Q814.2, TQ460.1 文献标志码：AProgress on Lipase Immobilization and its Application in Pharmaceutical SynthesisZHOU Yamei ， LIU Jia ， LU Dan ， KONG Qingxin *Department of Pharmaceutical Engineering ， Chongqing Chemical Industry Vocational College ， Chongqing 401228， ChinaAbstract ：As a commonly used biocatalyst ， lipase is widely used in pharmaceutical ， food and biochemical applications. However ， the application of lipase in enzyme catalysis industry was limited because of its poor stability of free lipase ， susceptibility to the environment and poor reusability. In response to the shortcomings of free lipase in the field of catalysis ， enzyme immobilization technology was developed. The immobilization of lipases has greatly improved their original catalytic activity and stabilityand has led to a wider range of industrial applications. The use of immobilized lipases with their own excellent properties selectively catalyses the synthesis of the desired product with mild reaction conditions ， high yields and few side reactions. The research and applications of lipase immobilization and its use in pharmaceutical synthesis were reviewed and the future of immobilized lipases was given ， which was expected to provide reference for the application of immobilized lipase in industry.Key words ：lipase ； immobilization ； catalysis ； pharmaceutical synthesis脂肪酶（lipase ），亦称三酰基甘油水解酶，隶属于羧基酯水解酶类，广泛存在于动植物（如胰脏、脂肪、油料作物的种子）和微生物（如霉菌、细菌等）中。

粗状假丝酵母(Candida valida T2)生产脂肪酶的发酵条件

母引、一根霉、霉和假单胞菌青
等，中假其
丝酵母（ａｄｄ）目前国内外研究较多 பைடு நூலகம்产Ｃｎｉａｓ是ｐ．
脂肪酶菌种。ＢＳＫｉ等＿利用高密度发酵柱状．．ｍ８假丝酵母（ａｄｄｙｉｄａｅ）Ｃｎｉａｃｌｒｃａ生产脂肪酶，高ｎ最
摘要：对粗状假丝酵母产生脂肪酶的培养条件进行了研究。结果表明，菌株产脂肪酶的适宜该
培养基组成为：油１／黄豆粉３／，桐５ｍＬＬ，０ｇＬ糊精１／，酸铵１／，Ｓ・Ｈ２ｇＬ，０ｇＬ硝０ｇＬＭｇＯ７Ｏ１／
Ｊ１２０ｕ．０７
文章编号：６３１８（０７０ —０２０１７ —６９２０３０６—５Ｊ
粗状假丝酵母（ａｄｄａｉａＴ）Ｃｎｉａｖｌ２生产ｄ脂肪酶的发酵条件
肖海群，段学辉，牛春铃
（昌大学食品科学教育部重点实验室，西南昌３０３）南江３０１
发酵水平达到２．ｍＬ；Ｌｕ９等通过大肠杆３１Ｕ／Ｄ．ｉｌ
菌进行南极假丝酵母脂肪酶基因表达，酵酶蛋白发活力达到６ｍｇ何耀强等ｌ一株突变高产脂１Ｕ／；＿１对
维普资讯
第２６卷第４期２００７年７月
食品与生物技术学报
ＪｕｎｌｏｏｃｅｃｎｏｅｈｏｏｙｏｒａｆＦｏｄＳｉｎｅａｄＢｉｔｃｎｌｇ

脂肪酶

脂肪酶催化药物合成院系：化工学院班级： 2009级制药工程2班学号： 20009650818姓名：李红霞脂肪酶催化药物合成摘要：将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分等研究。

常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。

从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。

关键词：脂肪酶；酶催化；手性拆分；药物合成；应用一、综述脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。

在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。

脂肪酶结构有2个特点：(1) 脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser- W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；(2) 活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护。

脂肪酶的特性脂肪酶底物专一性酶的底物专一性取决于酶分子结构，脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成。

活性中心靠近分子疏水端。

不同来源的脂肪酶存在着结构上的差异，使得不同的来源的脂肪酶有不同的底物专一性。

1.1来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

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实验步骤
4.游离酶的循环转脂酶活测定：
取两个三角瓶，分别加入橄榄油乳化液5mL，pH缓冲液（0.05mol/L 甘氨酸－NaOH缓冲液）4mL，35℃水浴加热 5min（预热）后，取其中一个三角瓶加入200mg酶粉，反应10min，加入15mL 95%乙醇中止反应。另一个三角瓶先加15mL95%乙醇后再加200mg酶粉；两个三角瓶各加入2 滴酚酞溶液作指示剂，用NaOH溶液滴定，直至反应液微红色并保持30s不退色为终点。用pH计测定此时溶液的pH 值，对照组滴定终点便是此pH（9.0）。记录消耗NaOH溶液的体积。
II.固定化方法：将0.60g海藻酸钠放入50mL烧杯中，加入20mL
蒸馏水，35℃水浴加热溶解，待溶液冷却后，混合海藻酸钠溶液与酶液，用针形注射器滴入凝结剂（1% CaCl2）溶液中， 35℃恒温固定化1h，便制得固定化脂肪酶，过滤，用无菌蒸馏水淋洗4次，室温干燥。实验结果Leabharlann 1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶
固定化酶出现下降趋势分别是在第14次、第17次和第
10次。
结论
1.脂肪酶的固定化操作过程会造成酶活性的损失。
2.通过实验发现使用海藻酸钠包埋法和壳聚糖—戊二醛交联法制备的固定化酶的水解酶活相对硅藻土吸附法较高，分别为78.0U/mg和 75.6U/mg。 3.使用壳聚糖—戊二醛交联法制备的固定化酶的重复使用率最高，在反应17次后的残余酶活为84.1%；海藻酸钠包埋法制取的固定化酶在反应第14次后的残余酶活为84.6%；硅藻土吸附法制取的固定化酶在反应第10次后的残余酶活为80.0%。 4.三种固定化方法中，硅藻土吸附法和海藻酸钠包埋法操作较为简单，壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化脂肪酶用时最长。
实验结果
2.壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化酶
这种固定化酶为黄色固体颗粒，循环使用时只需倒掉反应液就可以直接取出固定化酶，操作简单。
实验步骤
3.硅藻土吸附法制备固定化酶
I. 酶液的制备：将 200mg 酶粉溶解于 40mL 的 0.025mol/L 磷酸缓冲液
(pH7.5)中，便制得浓度为5g/L的酶液。
这种固定化酶为球状固体，颜色乳白接近透明，循环使用时只需倒掉反应液就可以直接取出固定化酶，操作简单。
实验步骤
2.壳聚糖—戊二醛交联法制备固定化酶
I. 壳聚糖颗粒的制备：取 1.00g的壳聚糖溶于 30mL1%的乙酸溶液中，
35 ℃水浴加热使其充分溶解形成胶状溶液，用注射器滴入凝结剂 (1mol/L的NaOH溶液)中形成球状颗粒，便制得壳聚糖颗粒。水洗至中性，室温干燥。
实验结果
4.游离酶的循环转脂酶活测定结果：
如图所示，游离酶在循环利用8次后，酶活由初始的80.4U/mg变为 33.0U/mg，反应至第10次的酶活更是降至13.2U/mg。
实验步骤
5.固定化酶的循环水解酶活测定：
实验共制得三种固定化酶，按照游离酶循环水解酶活的测定方法分别滴定三种固定化酶，记录消耗的NaOH溶液的体积，并计算固定化酶的水解酶活。注意将固定化酶全部取出，即固定化酶含有脂肪酶的质量为200mg。重复操作，直至酶活明显降低，计算固定化酶的酶活回收率。
皱褶假丝酵母脂肪酶的固定化方法比较研究
姓名：崔莹莹
专业：生物工程
学号：201102010129
指导老师：李璟
背景
脂肪酶作为最主要的工业酶制剂之一，能够催化油脂类分解、交换、合成等酶促反应，脂肪酶的固定化技术，不仅能够实现重复利用和自动化生产，亦可以大大提高酶的贮存稳定性，使成本下降，在食品工业、纤维及造纸工业、生物能源、制药工业、生物感应器工业等领域的应用前景非常广泛。
实验步骤
橄榄油乳化法是使用最普遍的测定酶活方法，本实验采取此方法测定酶活性及酶活回收率。酶活计算公式：U=(V-V’)×n×k×m/t U－样品的酶活力； V－滴定样品时消耗NaOH 标准溶液的体积/ml； V’－滴定对照组时消耗NaOH标准溶液的体积/ml； n－酶液的稀释倍数； k－指1mL碱中所含有的OH—的微摩尔数； m－固定化初始加入微生物脂肪酶的质量； t－反应时间/min。
实验结果
5.固定化酶的循环水解酶活测定结果：
如图所示，海藻酸钠包埋法制取的固定化酶在循环利用第14次后，
酶活由初始的78.0U/mg变为66.0U/mg，反应至第16次后残余酶活还
有33.6U/mg；壳聚糖—戊二醛交联法制取的固定化酶在循环利用第17次后，酶活
由初始的75.6U/mg变为63.6U/mg，反应至第19次后残余酶活还有
45.0U/mg；硅藻土吸附法制取的固定化酶在循环利用第10次后，酶活由初始的 57.0U/mg变为45.6U/mg，反应至第16次后残余酶活还有25.2U/mg。
实验结果
6.游离与固定化脂肪酶循环水解酶活的比较
游离酶初始酶活最高，海藻酸钠包埋法和壳聚糖—戊
二醛交联法制备的固定化酶次之，硅藻土吸附法固定化的脂肪酶酶活最低；游离酶循环水解酶活下降迅速，在反应至第5次时就开始出现下降趋势，而海藻酸钠包埋法和壳聚糖—戊二醛交联法和硅藻土吸附法制备的
II.固定化酶的制备：将1.00g的硅藻土加入酶液中，35℃恒温固定化
1h后，将固定化载体用丙酮淋洗4次，每次淋洗后4000r/min离心收集固体，使载体颗粒分散，室温干燥。
实验结果
3.硅藻土吸附法制备固定化酶
这种固定化酶为白色粉末状固体，循环使用时可以用过滤、离心等方法取出固体的固定化酶，操作比较简单。
II.酶液的配置：200mg脂肪酶溶于40ml的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)
中，制得5g/L的酶液；
III. 固定化方法：取壳聚糖颗粒 0.40g ，加入 0.05%戊二醛 5mL 交联 1h，
用无菌蒸馏水淋洗载体，放入酶液，35℃恒温固定化1h，过滤，用
无菌蒸馏水淋洗4次，室温干燥，便制得固定化脂肪酶。
实验步骤
4.游离酶的循环转脂酶活测定：
将所有反应液倒入50ml离心管，4000r/min离心10min，倒出上清液将沉淀用无菌蒸馏水淋洗2次（每次洗涤过后都要再4000r/min离心10min），然后将沉淀（游离酶）加入另一个含新鲜乳化液的三角瓶中，反应10min，测定水解酶活。上述操作重复10次，计算游离酶的酶活回收率。
目的和意义
但目前我国脂肪酶的研发及产业化水平与国外存在较大差距，而且对于脂肪酶的固定化方法没有进行过系统的比较研究。本研究采用不同方法固定化相同质量的皱褶假丝酵母脂肪酶，通过测定游离脂肪酶及固定化酶的循环水解酶活得到固定化酶对比游离酶的优势，并比较不同固定化酶方法的优劣，为今后深入对微生物脂肪酶固定化的研究提供参考依据。
实验流程
1.使用不同方法固定化相同质量的皱褶假丝酵母脂肪酶
2.采用橄榄油乳化法测定游离酶与固定酶的循环水解酶活 3.通过循环水解酶活的变化比较不同固定化酶方法的优劣
实验步骤
1.海藻酸钠包埋法制备固定化酶
I. 酶液的配制：称取脂肪酶 200mg ，用 pH 为 5.8 的 NaH2PO4-
Na2HPO4 缓冲溶液，稀释至40mL ，即配制成浓度为 5g/L 的酶液。