第十二章 核酸探针检测技术

现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。

二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。

三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。

核酸荧光探针技术在动态细胞学中的应用随着科技的发展，人们对生命的了解越来越深入。

动态细胞学是研究细胞内分子在时间和空间上的变化规律以及与生命活动密切相关的过程的学科。

而核酸荧光探针技术是在细胞学研究中广泛应用的技术之一。

本文将会详细介绍核酸荧光探针技术在动态细胞学中的应用。

一、核酸荧光探针技术基础核酸荧光探针具有良好的特异性和灵敏度，是目前研究RNA 和DNA等核酸结构、性质和功能的一种重要手段。

核酸荧光探针通常是由荧光物质和一定长度的核酸序列组成。

荧光物质能够将非辐射能量转化为可见光，并且在荧光物质激发下，核酸链能够展开，形成荧光复合物。

利用核酸荧光探针，可以对目标分子进行准确、特异性的检测和定量（如实时定量PCR）。

基于核酸荧光探针技术，近年来还发展了RNA荧光原位杂交（FISH）和光学结构测序（super-resolution microscopy）等新技术。

二、 2.1 在细胞周期和凋亡中的应用细胞周期对于细胞存活和繁殖具有至关重要的作用。

通过核酸荧光探针技术可以实时追踪细胞周期中的DNA复制和细胞有丝分裂过程中染色体的构象变化，既可以帮助解析细胞周期的分子机制，也可以用于筛选细胞周期调控的药物靶点。

此外，核酸荧光探针还可以用于检测细胞凋亡信号通路中的关键基因的表达及调控，如bcl-2家族的关键因子bax、bcl-xl等，既可以揭示细胞凋亡过程的分子机制，也可以为肿瘤治疗等提供新的研究思路。

2.2 在基因表达和蛋白质翻译调控中的应用核酸荧光探针还可以用于研究基因表达及蛋白质翻译调控等相关细胞过程。

对于真核生物，核糖体合成蛋白质的过程是一个非常复杂的过程。

利用荧光标记探针可以为研究者提供细胞内蛋白质定位和共定位的信息，并通过不同通道的每个探针产生的荧光来量化底物的含量和活性。

同时，还可以通过使用超分辨成像技术来了解蛋白质的亚细胞运动和相对定位，从而了解相关功能。

2.3 在病毒和细菌感染中的应用核酸荧光探针还可以应用在病毒和细菌感染领域。

特异性核酸探针技术在疾病诊断中的应用随着科学技术的进步与发展，人们的健康问题也日益受到重视，尤其是各种疾病的诊断，成为医学领域中不可或缺的一部分。

作为一种新兴的技术手段，特异性核酸探针技术在疾病的检测和诊断方面有着广阔的应用前景。

本文将介绍这种新技术的定义、原理、应用和不足之处。

一、特异性核酸探针技术的定义特异性核酸探针技术是一种在分子水平上检测DNA或RNA序列的技术，其主要是建立在核酸杂交原理上的。

利用一段互补于待检测的DNA或RNA分子序列的标记有色或荧光的寡核苷酸探针，通过与待检测分子进行特异性识别和杂交反应，从而使标记荧光信号的产生，并对目标分子的存在与否进行精确的检测和分析。

二、特异性核酸探针技术的原理特异性核酸探针技术的核心原理是互补配对和封口作用。

核酸探针通过与待检测的分子发生互补配对，然后再通过封口作用来做出结果。

封口指的是分子间的万有引力使探针与待检测分子的碱基配对，而双链末端的物理结构二次解旋会另探针脱离碱基配对所产生的笼合态（quencher），这就控制了PCR过程中的非特异性反应，提高PCR检测的灵敏度和特异性。

三、特异性核酸探针技术的应用特异性核酸探针技术在疾病诊断和基因检测方面具有较为广泛的应用，包括以下应用：1. 肺癌检测：特异性核酸探针技术可以在早期肺癌检测中起到很大的作用。

这需要快速检测样品中肺癌相关基因、突变或表达量的变化。

2. 微生物感染检测：该技术可以及时检测出样品中可能存在的微生物感染，进而实现对病毒、细菌和真菌等致病微生物的快速检测。

3. 常见疾病检测：特异性核酸探针技术还可以用于对乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌和结直肠癌等常见癌症进行快速检测。

4. 特定基因检测：该技术也可以用于特定基因的检验，譬如血透患者的交叉感染、染色体特定序列和基因点突变等的检测。

在这些情况下，特异性核酸探针技术可以快速、准确而有效地检测出这些基因的存在与否。

四、特异性核酸探针技术的不足之处虽然特异性核酸探针技术有着多方面的优点，但仍然存在一些不足之处：1. 特异性不高：感兴趣的区域会受到引物设计的影响，所以特异性转化率越来越小。

核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。

抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

核酸探针技术原理是碱基配对。

互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。

每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。

(一) 核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。

其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。

将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。

cDNA探针适用于RNA病毒的检测。

cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。

将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。

但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。

用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。

放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。

放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。

常用的同位素有32P、3H、35S。

其中，以32P应用最普遍。

放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。

简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。

在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。

核酸探针是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。

根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA 探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。

这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。

如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。

选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。

1 核酸探针的特点：1.1探针的特异性核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。

对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。

以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。

检测这种物质受多种因素影响。

比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。

核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。

近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。

本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。

一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。

它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。

这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。

正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。

因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。

二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。

再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。

安全与检测SAFETY AND TESTING41DEC. 2020CFI 核酸探针和PCR 技术在食品检验中的应用席少华　浮山县综合检验检测中心　山西临汾　042600作者简介:席少华（1982.9—）男，汉族，山西曲沃，大学本科，工程师，研究方向:食品检验。

摘要：多聚核酸酶链探针聚合技术和新型多聚核酸酶链聚合反应(polymerasechainreaction，PCR)两个技术分别是近年来迅速发展应用起来的两种高新层次生物技术。

本文主要着重详细介绍了应用核酸pr探针检验技术和核酸PCR探针技术的工作原理及其在现代食品科学检验技术中的实际应用。

同时还提出了这两种高新技术在我国食品安全检验中尚普遍存在的一些问题以及目前的具体解决办法，并对其在我国食品安全检验行业中的实际应用以及前景研究作了总体展望。

关键词：核酸探针生物技术；PCR生物技术；核酸食品安全检验技术核酸探针生物技术和新型多聚核酸酶链催化反应(polymerasechainreaction，PCR)两种技术分别是近年来迅速发展应用起来的两种高新层次生物技术。

自其产品问世以来，已在许多专业领域中得到了广泛的研究应用。

本文将对这两种检测技术在我国食品安全检验行业中的实际应用前景作一定的综述。

1核酸探针检测技术的基本原理碱基配对是核酸检测的基本原理之一。

互补链是两个线性核酸退火形成的双链，也称为线性核酸双链杂交。

核酸基因探针一般是指具有已知核酸序列的特定核酸基因片段与核酸标记物。

它通常能和与其序列互补的特定核酸基因序列杂交形成双链。

因此，该探针可应用于待检测的多种特异性核酸基因样品中特异性核酸基因已知序列的核酸检测。

每种病原体都可能有一个独特的核酸分离片段。

通过核酸分离和复制标记，这些核酸片段可用于制备用于疾病早期诊断和其他医学研究的放射医学探针。

2核酸探针检测技术在各类食品细菌检测技术中的广泛应用2.1以cnDNA 为靶点和目标的食品检验中国近期开展的各类食品细菌微生物化学检验检测项目主要内容包括食品细菌个体总数、大肠菌群、沙门菌、霉菌和各种酵母以及生物毒素等。