核酸探针

现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。

二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。

三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。

核酸检测原理是啥
核酸检测是一种常用的检测方法，用于检测病原体如病毒、细菌等体内的核酸。

其原理主要通过PCR（聚合酶链反应）技
术来实现。

首先，从病原体中提取出核酸样本，这样就可以将核酸分离出来。

然后，将核酸样本与特定的引物和荧光探针（也称为探针）反应。

引物是在特定核酸序列上的寡核苷酸，它可以与核酸样本中的目标序列结合。

探针是由荧光染料标记的核酸片段，其序列与目标序列配对。

在PCR反应中，引物和探针将与目标序列特
异性结合。

PCR反应开始后，通过一系列的温度循环，DNA聚合酶酶会
不断复制目标序列，并将目标序列扩增。

在每一个PCR循环后，荧光探针会被酶切，释放出的荧光信号被检测器记录。

通过PCR扩增的过程，如果样本中存在目标序列，经过多个
循环便可得到足够的扩增产物，这些产物会通过荧光信号显示出来。

反之，如果样本中不存在目标序列，则不会有荧光信号产生。

通过检测器记录荧光信号的强度，可以判断样本中是否含有目标核酸序列。

这种核酸检测方法可以快速、精确地确定病原体是否存在，用于疾病的诊断和监测。

如何自制核酸探针？什么是核酸探针？核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。

通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。

这一过程被称为核酸杂交。

其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。

探针应用核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。

探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。

探针制备探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。

探针制备流程如图1所示。

Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。

而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。

除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。

图1. 探针制备流程。

随机引物法随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。

如果模板是RNA，则使用反转录酶。

随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。

相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。

图2. 随机引物法的原理。

Protocol试剂：[α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物，NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。

常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。

利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。

同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。

图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。

但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。

双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。

2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。

3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。

当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。

图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。

2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。

3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。

按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。

3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。

其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。

核酸探针的名词解释
嘿，咱今天就来聊聊核酸探针这玩意儿！你知道吗，核酸探针就像
是一个超级侦探，专门去寻找特定的核酸序列。

比如说吧，就好像你
在一个超级大的图书馆里找一本特定的书，核酸探针就是那个能精准
找到那本书的小能手！
它是一小段经过标记的核酸分子，这个标记就像是给它装上了一个
闪闪发光的信号灯。

然后呢，它就可以和目标核酸序列特异性地结合。

这就好比是一把钥匙开一把锁，可准了呢！
咱举个例子啊，想象一下，细胞里面的核酸就像是一群人，而核酸
探针就是那个能准确找到特定那个人的高手。

它能一下子就抓住目标，然后通过那个标记，让我们知道它找到了。

核酸探针的作用可大了去了！它可以用来检测病毒、细菌，还能在
基因诊断中发挥重要作用。

比如说，当我们怀疑身体里有某种病毒的
时候，核酸探针就能快速地找到它，告诉我们是不是真的有。

这多厉
害啊！
在科学研究中，核酸探针也是不可或缺的。

研究人员用它来探索基
因的功能，就像探险家在未知的领域寻找宝藏一样。

你说，核酸探针是不是超级神奇？它就像是一个默默无闻却又超级
厉害的小英雄，在我们看不见的地方发挥着巨大的作用。

总之，核酸探针就是那个能在核酸世界里精准定位、发挥关键作用的神奇存在！它是现代生物学和医学的重要工具，为我们解开生命的奥秘提供了有力的支持。

没有它，很多事情我们可都没法做呢！。

核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。

近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。

本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。

一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。

它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。

这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。

正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。

因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。

二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。

再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。

科目：食品生物技术导论学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术班级：090551学号：09055106姓名：黄菁核酸探针技术在食品检测中的应用摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。

关键词：食品检测核酸探针基因工程The nucleic acid probe of the application of the technique in food testingAbstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction.Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。

长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。

生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。

生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。

分子生物学探针的名词解释分子生物学探针，是一种广泛应用于分子生物学研究中的工具。

它们通常是人工合成的小分子，具有特定的生物学性质，可用于识别、定位和标记目标分子。

这些分子生物学探针在生物学实验中发挥着关键的作用，使研究者能够更深入地了解生命现象，揭示细胞机制，甚至开发新的药物治疗手段。

一、荧光探针荧光探针是最常见和广泛应用的一类分子生物学探针。

它们通过与目标分子发生相互作用，并发出特定的荧光信号来实现目标分子的检测和追踪。

荧光探针通常由两个主要组成部分构成：荧光染料和连接分子。

荧光染料具有发出荧光的能力，而连接分子可与目标分子特异地结合，将荧光信号传递给目标分子。

荧光探针在生命科学研究中被广泛应用，如细胞成像、蛋白质定位和分离、DNA/RNA检测等。

二、酶探针酶探针也是重要的分子生物学探针之一。

它们利用特定酶的催化活性来实现目标分子的检测和定量。

通常，酶探针由两个部分组成：底物分子和信号分子。

底物分子在酶的催化下发生特定的反应，生成一种可检测的产物。

而信号分子则能与底物分子发生特定的相互作用，产生检测信号。

酶探针广泛应用于酶活性测定、代谢途径研究、蛋白质检测等领域。

三、合成探针合成探针是指通过人工合成的方法获得的分子生物学探针。

它们具有特定的结构和化学性质，可用于探测目标分子的存在和活性。

合成探针可以分为多种类型，如核酸探针、蛋白质探针和药物探针等。

核酸探针常用于检测和分析DNA/RNA的序列、结构和功能。

蛋白质探针用于研究蛋白质的结构、相互作用和功能。

药物探针则被设计用于发现和研究靶向特定分子的药物。

四、纳米探针纳米探针是一种基于纳米技术的分子生物学探针。

它们具有纳米尺度的尺寸，能够在分子和细胞水平上进行精确的探测和操作。

纳米探针通常由纳米材料、生物分子和信号发生器组成。

纳米材料如金颗粒、碳纳米管和磁性纳米颗粒等，可用于传递和放大信号。

生物分子如DNA和蛋白质等，可结合目标分子实现特异性识别和测量。

核酸探针的名词解释核酸探针是一种生物技术工具，用于检测和定量分析某个特定的核酸序列。

核酸探针广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域，发挥着重要的作用。

本文将对核酸探针进行全面的解释和概述。

首先，核酸探针是由特定的DNA或RNA序列构成的分子探针，可以与目标核酸序列发生亲和作用。

这种亲和作用是通过碱基之间的氢键和静电相互作用来实现的。

当核酸探针与目标序列结合时，可以通过不同的手段进行检测，如荧光、放射性同位素、酶等。

因此，核酸探针可以用于检测及定量分析目标核酸的存在和数量。

核酸探针通常分为两类：探针和探针靶标。

探针是指通过标记物标记的核酸序列，用于寻找、结合和识别特定的目标序列。

标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶等，通过这些标记物的特性，可以将目标序列的存在转化为可见的荧光信号或颜色变化等。

探针的设计需要根据目标序列的特点和要求进行选择，以确保能够高效地与目标序列结合。

而探针靶标是指与探针结合的目标核酸序列。

探针靶标可以是基因、RNA、病毒等，通过与探针的结合，可以准确地检测和定量目标核酸的存在和数量。

探针靶标的选择是基于研究的目的和所需的结果，不同的探针靶标可以提供不同的信息和数据。

核酸探针的优点是具有高度的特异性和灵敏性。

由于核酸探针是专门设计的，可以针对目标序列的独特特点进行选择和设计，使其具有非常高的特异性。

此外，核酸探针的灵敏性也很高，可以检测到非常低浓度的目标分子。

因此，核酸探针常被用于疾病的早期诊断、药物研发、基因工程和环境监测等领域。

然而，核酸探针也存在一些限制和挑战。

首先，核酸探针对目标序列的特异性要求非常高，如果目标序列发生了变异或突变，可能会导致探针无法与其结合，从而导致检测结果的错误。

此外，核酸探针的设计和合成成本相对较高，需要专业的实验室和设备支持。

因此，在使用核酸探针进行研究和应用时，需要充分考虑这些限制和挑战。

目前，核酸探针已经广泛应用于各个领域。

在生命科学研究中，核酸探针常用于基因表达分析、突变检测、病毒感染研究等。

taqman探针原理TaqMan探针原理。

TaqMan探针是一种广泛应用于分子生物学领域的核酸检测技术，它以其高度特异性和灵敏度在基因表达分析、基因突变检测、病毒核酸检测等方面发挥着重要作用。

TaqMan探针的原理基于荧光共振能量转移技术，下面我们将详细介绍TaqMan探针的工作原理。

TaqMan探针是一种双标记的寡核苷酸探针，包括一个荧光素和一个荧光淬灭素。

在PCR扩增过程中，TaqMan探针与待检测的靶标DNA序列特异性结合，当Taq聚合酶在扩增过程中到达TaqMan探针的结合位点时，它会具有3'→5'外切酶活性，开始在探针的5'端和3'端之间的靶标DNA序列上进行切割。

这导致荧光素和荧光淬灭素被分离，从而释放出荧光信号。

PCR扩增过程中，每一个TaqMan探针都会释放出荧光信号，而这些信号的累积可以被检测仪器实时监测到。

TaqMan探针的工作原理可以简单概括为“切割-释放-检测”。

在PCR扩增的每一个循环中，TaqMan探针都会与靶标DNA序列结合并被Taq聚合酶切割，释放出荧光信号。

通过实时监测这些荧光信号的累积，可以准确地确定靶标DNA序列的存在与数量。

TaqMan探针的工作原理使得它在核酸检测中具有很高的特异性和灵敏度。

首先，TaqMan探针与靶标DNA序列的特异性结合确保了检测结果的准确性，不会受到非特异性扩增的干扰。

其次，TaqMan探针释放的荧光信号可以实时监测到，使得检测结果可以在PCR扩增过程中得到，大大缩短了实验周期。

此外，TaqMan探针还可以同时检测多个靶标DNA序列，适用于复杂样品的分析。

除了在科研领域的应用，TaqMan探针在临床诊断、食品安全监测、环境污染检测等领域也发挥着重要作用。

例如，在临床诊断中，TaqMan探针可以用于检测病原微生物的核酸，帮助医生准确诊断疾病。

在食品安全监测中，TaqMan探针可以用于检测食品中的致病微生物，确保食品安全。

核酸引物探针质量技术要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：核酸引物探针是分子生物学实验中常用的一种工具，用于特异性检测和测定目标DNA或RNA序列。

其质量的好坏直接影响实验结果的准确性和可靠性。

制定和遵守一定的技术要求对于保证核酸引物探针的质量至关重要。

一、引物序列设计核酸引物探针的设计是其质量的重要基础。

在设计引物时，需要考虑以下几个方面：1. 引物的长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，需要保证引物足够长以确保特异性结合目标序列，同时又不能过长影响反应效率。

2. 引物的GC含量：引物中GC含量的合理范围通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。

3. 引物的特异性：引物的特异性是指引物与目标序列的互补性，需要确保引物与非目标序列的互补性尽可能小以避免干扰。

4. 引物的末端结构：引物的末端结构需要考虑到PCR扩增、杂交和捕获等不同实验操作的需求，合理设计引物的末端结构有助于提高实验效率。

二、引物检测和验证在使用核酸引物探针前，需要对引物进行检测和验证，以确保其质量符合要求。

主要检测方法包括：1. 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，检测引物的纯度和长度。

2. 透射电子显微镜观察：可以通过透射电子显微镜观察引物的形态和结构，判断引物的合成质量。

3. 质谱分析：利用质谱分析技术，可以检测引物的精确质量和序列。

三、引物处理和保存引物的处理和保存也对其质量起到重要影响，以下是一些常用的处理和保存方法：1. 复溶：引物在使用前需要以适当的溶剂复溶，避免在处理过程中引物受损。

2. 冻干：可以利用冻干技术将引物保存在干燥状态，减少引物的降解和污染。

3. -20℃或更低温度保存：引物应该保存在-20℃或更低的温度下，避免被高温或光照导致降解。

四、实验操作规范在进行核酸引物探针实验时，需要严格遵守实验操作规范，包括以下几个方面：1. 避免污染：实验前准备工作台、试剂和仪器时要避免污染，以确保实验结果的准确性。

核酸分子杂交的概念、基本原理、探针及类型分子杂交的概念及基本原理主要内容：一、分子杂交的概念二、分子杂交基本原理（一）DNA 变性：1、D NA变性的方法2、增色效应3、溶解曲线4、融解温度5、影响Tm值的因素。

（二）复性：退火一、分子杂交的概念：分子杂交（molecular hybridization ）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA ），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

二、分子杂交基本原理：（一）DNA 变性：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。

1、D NA变性的方法：1）加热；2）改变DNA溶液的pH ；3）有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。

2、增色效应：DNA在260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。

在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect ）。

利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。

3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature ，Tm ）。

因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：1）部因素：pH、离子强度。

随着溶剂内离子强度上升，Tm 值也随着增大。

核酸探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。

下面分别介绍这几种探针。

（一）DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。

现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。

这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。

这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。

以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。

加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。

细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。

各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。

然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。

将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。

因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。

探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。

用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。

对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。

原位杂交实验所用探针原位杂交实验所用探针杂交实验所选择的核酸探针可以分为两种：克隆的或合成的。

实验中，应根据不同的杂交实验选择相应的核酸探针。

一般来说，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。

特别是当存在特异的克隆，或当DNA序列未知而又必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，常常选用克隆探针。

RNA探针也是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶核酸序列的杂交反应效率极高。

克隆探针一般比寡核苷酸探针的特异性强，复杂性也高，并可获得强的杂交信号。

合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂度低，相对分子质量小，所以，和等量靶位完全杂交的时间较克隆探针短；②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因此短探针中碱基的错配能大大降低杂交体的Tm值；③可大量合成，价格廉价。

在分子杂交技术的发展早期，较多使用放射性同位素如32P、35S等来标记核酸探针，在相当一段时间内，放射性同位素被视为探针的传统标记物且发挥着重要作用，它有十分明显的优点如灵敏度高、特异性高以及方法成熟简便。

但随着分子杂交技术的发展，它的缺陷也越发突出：半衰期短，必须经常标记探针：如32P半衰期只有14.2天，放射强度逐渐衰减。

35S的半衰期可达88天，但衰变能量只有32P的1/10，灵敏度较低，只能用于多拷贝基因的检测。

3H的半衰期虽长达12.3年，但衰变能低，灵敏度太低。

费用高：需要用进口试剂，价格高。

检测时间长：用放射自显影需要较长的暴光时间。

放射性同位素对人体有害，实验室和环境容易被污染，放射性废物处理困难。

因此，推广使用受到限制。

鉴于放射性标记探针在使用中的局限，促使非放射性标记核酸探针得以迅速发展，现在许多领域已用非放射性标记核酸探针取代放射性标记核酸探针，从而推动了分子杂交技术的发展和广泛应用。

目前，非放射性标记法可以分为两大类：一类为酶促标记法，另一类为化学标记法。

酶促标记法常可更好地修饰DNA，以产生比非酶促法高的敏感性。

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