慈菇支链淀粉的分离纯化及其分子结构研究

慈菇支链淀粉的分离纯化及其分子结构研究王素雅，曹崇江，杨玉玲，刘长鹏，丁　男，谢　群（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油食品检测与深加工重点实验室，江苏　南京 ２１０００３）摘 要：本研究采用正丁醇法对慈姑支链淀粉与直链淀粉进行分离，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ凝胶层析表明支链淀粉得到纯化。

采用酶法分析了慈姑支链淀粉的分子结构，结果表明慈姑支链淀粉的平均链长（ＣＬ）为２２，其中外链长（ＥＣＬ）为１４，内链长（ＩＣＬ）为７。

异淀粉酶和普鲁兰酶依次作用于慈姑支链淀粉的β－极限糊精，计算得支链淀粉Ａ链与Ｂ链比值为１．３３：１．０，分支化度为２．３３。

关键词：慈菇淀粉；分离；支链淀粉；分子结构Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｒｏｗｈｅａｄ　Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＷＡＮＧ　Ｓｕ－ｙａ，ＣＡＯ　Ｃｈｏｎｇ－ｊｉａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｕ－ｌｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｃｈａｎｇ－ｐｅｎｇ，ＤＩＮＧ　Ｎａｎ，ＸＩＥ　Ｑｕｎ（Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｆｕｒｔｈｅｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｏｉｌ，　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｆｉｎａｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００３，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ａｍｙｌｏｓｅ　ａｎｄ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ｏｆ　ａｒｒｏｗｈｅａｄ　ｓｔａｒｃｈ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｎ－ｂｕｔａｎｏｌ　ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．　Ｉｔ　ｗａｓｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ｗａｓ　ｐｕｒｅ　ｂｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ　ｃｏｌｕｍｎ．　Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｖｅｒａｇｅ　ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　（ＣＬ），　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ（ＩＣＬ）　ａｎｄ　ｅｘｔｅｒｉｏｒ　ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　（ＥＣＬ）　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ａｒｅ　２２，　１４　ａｎｄ　７，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　β－ａｍｙｌａｓｅ　ｌｉｍｉｔ　ｄｅｘｔｒｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎｗｅｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｄｅｂｒａｎｃｈｅｄ　ｂｙ　ｏｒｄｅｒｌｙ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ　ａｎｄ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓｅ．　Ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ａ　ｃｈａｉｎ　ａｎｄ　Ｂ　ｃｈａｉｎ　ｉｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　１．３３：１．０，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ａｒｒｏｗｈｅａｄ　ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ　ｉｓ　２．３３．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｒｒｏｗｈｅａｄ　ｓｔａｒｃｈ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中图分类号：ＴＳ２３５．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００９）０９－００２９－０４收稿日期：２００８－０８－０５基金项目：江苏省高校自然科学基金项目（０５ＫＪＢ５５００３４）作者简介：王素雅（１９６９－），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｓｙ＿ｗａｎｇｓｙ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。

直链淀粉是线性直链状分子，而支链淀粉具有高度分支。

一种淀粉中直链淀粉与支链淀粉的比例、直链与支链淀粉的聚合度、分子质量分布、支链淀粉的分支化度、平均链长等直接影响淀粉的物化特性与加工特性。

分离直链淀粉与支链淀粉的方法很多，主要分为两类，以溶解度为依据的分离方法，如温水抽提法、混合溶剂分离法、盐类分离法、聚合物控制结晶法等；另一类方法以直链与支链淀粉分子结构差异为依据，包括色谱分离法和纤维素吸附法。

其中以混合溶剂法中的正丁醇法最常用［１］。

支链淀粉是多数淀粉的主要成分，其精细结构包括分子的聚合度、平均链长、分支化度等。

关于支链淀粉分子结构的描述主要有如下一些参数［２］：外链长（ＥＣＬ）：非还原性末端至最外侧分支点的一段链长；内链长（ＩＣＬ）：相邻两个α－１，６－糖苷键分支点间的一段链长；平均链长（ＣＬ）：每一非还原末端基的链所含有的平均葡萄糖残基数。

支链淀粉共有Ａ、Ｂ、Ｃ三种糖链，Ｃ链为支链淀粉的骨架主链，具有一个还原性末端，每个分子只有一个Ｃ链；Ｂ链是经α－１，６－糖苷键与Ｃ链相连接的分支链；Ａ链通过还原性末端与其他链连接的链，是淀粉分子最外侧不含分支的链。

Ａ链与Ｂ链的比值实际上反映了支链淀粉分子的分支化度，分支化度定义为每条Ｂ链上所具有的Ａ链数目［２］。

本研究采用正丁醇沉淀法提取慈姑支链淀粉，通过凝胶层析法分析提取物的纯度，然后采用酶法测定支链淀粉分子结构，为今后更好的利用慈姑资源提供理论基础。

１材料与方法１．１材料与试剂慈姑淀粉由市售新鲜慈姑经碱提法制备；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；β－淀粉酶（ＥＣ３．２．１．２）与普鲁兰酶（ＥＣ３．２．１．４１） Ｓｉｇｍａ公司；异淀粉酶（ＥＣ３．２．１．６８）北京博仕奥生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

１．２仪器与设备ＤＳ－１高速组织捣碎机 上海标本模型厂；ＧＬ－２０Ｂ型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂；ＲＥ－５２ＡＡ旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；７２２Ｎ可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Ｈ２型蠕动泵和自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂；ＨＨ－６型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；ＬＧＪ－１０冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂。

１．３方法１．３．１慈姑直链淀粉和支链淀粉的分离纯化１．３．１．１直链淀粉与支链淀粉的粗分离在参照文献［３］方法的基础上进行改良。

称取慈姑淀粉２０ｇ，先用少量无水乙醇润湿，然后加入４００ｍｌ０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ溶液，在热水浴中加热分散至淀粉糊完全透明，冷却至室温，７８００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ除去不溶性杂质。

以２ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ将淀粉糊调至中性，加１８０ｍｌ正丁醇－异戊醇（３：１，Ｖ／Ｖ）溶液，在沸水浴中加热搅拌至体系透明，冷却至室温，置于４℃冰箱中过夜。

再离心（７８００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），沉淀物为粗直链淀粉，上清液为粗支链淀粉。

１．３．１．２支链淀粉的纯化向粗支链淀粉溶液中加入４０ｍｌ正丁醇，沸水浴中加热搅拌至透明，冷却，４℃冰箱中过夜。

７８００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，上清液按上述步骤重复操作数次。

上清液经真空浓缩后，用的无水乙醇进行沉淀，再以无水乙醇洗涤沉淀物数次，沉淀物于４０℃鼓风干燥，得纯化的支链淀粉样品。

１．３．２支链淀粉的凝胶过滤层析准确称取５０ｍｇ慈姑支链淀粉样品，加无水乙醇０．２ｍｌ，再加２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠０．５ｍｌ，充分振荡，加入２ｍｌ蒸馏水并振荡使淀粉溶解。

用１ｍｏｌ／Ｌ盐酸中和至ｐＨ７．０左右，将溶液定容至１０ｍｌ。

淀粉溶液经离心（３０００ｒ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ），取上清液。

层析条件：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２Ｂ层析柱（φ１ｃｍ×８０ｃｍ），取支链淀粉溶液２ｍｌ进样，以５０ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化钠溶液洗脱，洗脱速率８ｍｌ／ｈ，自动部分收集器收集洗脱液，每管收集２．５ｍｌ，取１ｍｌ收集液进行测定，用苯酚－硫酸法［４］测定其吸光度。

１．３．３慈菇支链淀粉β－淀粉酶水解率的测定与β－极限糊精的制备［５］将纯化的慈菇支链淀粉２ｇ分散于１００ｍｌ浓度为０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ５．０的醋酸缓冲液中，加入β－淀粉酶（４００μｌ，６５００Ｕ），并滴加２滴甲苯防止微生物生长，然后置于３７℃水浴保温。

在保温过程中，不断检测反应液的还原力，当反应液还原力不再升高时，将反应液置于沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，冷却，测定体系中的总糖（苯酚－硫酸法）和总还原力（ＤＮＳ法［４］），以不加酶的样品同样处理作为对照，计算慈菇支链淀粉的β－淀粉酶水解率。

剩余反应液加入３倍体积的甲醇，冰浴中放置３０ｍｉｎ后于３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，用７５％（Ｖ／Ｖ）甲醇溶液冲洗沉淀，冷冻干燥沉淀后得慈菇支链淀粉的β－极限糊精。

还原力（麦芽糖当量）β－淀粉酶水解率（％）　＝　——————————　×１００总糖（麦芽糖当量）１．３．４慈菇支链淀粉平均链长（ＣＬ）的测定［６］取纯化的慈菇支链淀粉５０ｍｇ分散于５ｍｌ，０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ５．０醋酸缓冲液中，加入普鲁兰酶（３５０μｌ，６Ｕ），同时滴加２滴甲苯防止微生物生长，３７℃水浴保温，在反应过程中，不断检测反应体系的还原力（以葡萄糖计），当还原力不再升高时，将反应液置于沸水浴灭酶２０ｍｉｎ，冷却，得到慈菇支链淀粉普鲁兰酶的脱支水解产物。

测定体系中的总糖和总还原力，以不加酶的样品同样处理作为对照，计算ＣＬ：产物中的总糖（葡萄糖当量）ＣＬ　＝—————————————— 产物中的总还原力（葡萄糖当量）１．３．５慈菇支链淀粉分支化度的测定［７］取２５ｍｇ慈菇支链淀粉β－极限糊精，以０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ５．０醋酸缓冲溶液５ｍｌ加热溶解，冷却。

向配制好的β－限制糊精溶液中加入异淀粉酶（１００μｌ，２０００Ｕ），３５℃水浴中保温２４ｈ还原力不再增加，加热灭酶，冷却。

再加入１００μｌ普鲁兰酶进行第二步脱支水解，直至还原力恒定，将反应液煮沸灭酶。

根据异淀粉酶与普鲁兰酶顺序脱支反应后的还原力计算慈姑淀粉的分支化度。

２结果与分析２．１慈姑支链淀粉的分离与纯化分离纯化是研究分子结构的前提和保证。

鉴于淀粉的结构特点和组成不均一性，至今尚没有一种方法能满足所有淀粉的分离。

将淀粉充分分散于碱液中，直链淀粉分子克服自身的内聚力而充分伸展，极性基团暴露，容易与正丁醇等极性化合物通过氢键相互缔合，形成结晶性络合物而沉淀。

而支链淀粉因分支化程度高，存在空间位阻，不易形成沉淀，从而使直链淀粉与支链淀粉发生分离［３］。

影响正丁醇法分离淀粉的因素很多，充分分散是两种成分分离的保障，因此实验中需要淀粉完全糊化并呈透明状。

由于低温有利于直链淀粉与正丁醇络合物结晶的沉淀，研究中需要将糊化后的淀粉溶液于４℃静止。

为了克服淀粉溶液中存在的黏滞作用，在两种成分分离时需要较大的离心力。

实验表明，当离心速率低于６０００ｒ／ｍｉｎ时，两组分分离效果不佳，而４℃以７８００ｒ／ｍｉｎ速率离心可使直链淀粉与支链淀粉分离。