α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
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α-淀粉酶抑制剂的提取、分离及性质研究的开题报告
α-淀粉酶抑制剂的提取、分离及性质研究的开题报
告
一、研究背景
α-淀粉酶是参与淀粉酶解的重要酶类之一，对其抑制剂的研究具有
十分重要的意义。
α-淀粉酶抑制剂可以调节血糖水平，减少糖尿病和肥
胖等疾病的发生。
因此，开展α-淀粉酶抑制剂的研究具有重要的应用前景。
二、研究目的
本研究的目的在于提取、分离α-淀粉酶抑制剂，并对其进行性质研究。
通过分析其分子量、化学结构和酶抑制活性，为进一步开发α-淀粉
酶抑制剂提供参考。
三、研究内容
1.提取、分离α-淀粉酶抑制剂：采用溶剂提取法和柱层析法分离纯
化α-淀粉酶抑制剂。
2.分子量分析：采用SDS-PAGE电泳法检测α-淀粉酶抑制剂的分子量。
3.化学结构鉴定：采用核磁共振（NMR）和质谱（MS）等技术对α-
淀粉酶抑制剂的化学结构进行鉴定。
4.酶抑制活性测定：采用体外酶活性测定技术，对α-淀粉酶抑制剂
的酶抑制活力进行测定。
四、预期结果
本研究预计可提取到α-淀粉酶抑制剂，并通过分子量分析、化学结
构鉴定和酶抑制活性测定分别对其进行定性、定量和定性分析。
预计能
够得到α-淀粉酶抑制剂的分子量、化学结构及其酶抑制活性等重要信息。
五、研究意义
通过本研究的开展，不仅有助于改善糖尿病和肥胖等疾病的治疗，还能够为进一步研发α-淀粉酶抑制剂提供参考，具有重要的理论和应用价值。
淀粉酶的提取--α-淀粉酶的提取、分离及测定
α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。
20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。
到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。
但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。
20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。
自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。
20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。
而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。
同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。
气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。
20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。
白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取纯化研究计划
全日制专业学位硕士研究生课程考试试卷（课程名称：植物生物技术概论）学位课 选修课□研究生年级：2013级姓名、学号：侯夏乐 2013050125学院（系、部）：农学院专业学科：作物学任课教师：韩德俊考试日期：2013年 12 月考试成绩：教师签字：白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取纯化研究计划研究背景α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，简称a-AI)是一种天然生物活性物质，属于糖苷水解酶的一种，国外称之为“starchblocker”。
a-AI能抑制肠胃道内唾液、胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到降低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高，从而有利于糖尿病患者的饮食治疗。
对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体重。
因此，可以用a-AI来防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。
天然存在的a-AI主要有3种类型，分别为[1](1)微生物产带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物；(2)微生物产多肽，如paim(来自微生物的猪胰a-AI淀粉酶抑制剂)和Haim(微生物起源人a-淀粉酶抑制剂)；(3)在豆类、谷类及其他较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。
Bowman(1945年)首次报道从芸豆中获得a-A1[2]。
白芸豆中提取的a，AI是一种具有N端糖基化的糖蛋白[2]。
作为一种热稳定的糖蛋白，a-AI 是在内质网上合成，储存在液泡内，要经过蛋白水解酶水解去抑制作用才能成为有活性的a-AI。
芸豆中发现的a-A1[3]已有3种，分别是aAI-1、aAI-2和aAI-3。
其中从芸豆中分离纠的aAI-1，是由两个糖肽亚基α(7．8 kD)和β(14 kD)组成。
它能抑制猪胰腺淀粉酶(PPA)、人胰腺淀粉酶、人唾液腺淀粉酶和一些鞘翅昆虫四纹豆象、绿移象、粉虫的α-淀粉酶。
张琪等的实验研究表明[4]a-AI能降低小肠各部分尤其是小肠前端的二糖酶活性。
玉米α-淀粉酶抑制剂的分离纯化及性质研究
玉米α-淀粉酶抑制剂的分离纯化及性质研究α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor,α-AI）,是一种天然生物活性物质,因为对昆虫消化道、哺乳动物唾液及胰淀粉酶具有特殊的抑制活性,被称为“淀粉阻断者”（starch blocker）。
因此,α-AI被用于医疗、农业以及酶工程等各个领域。
本试验研究目的是筛选α-AI含量较高的玉米品种,确定提取玉米α-AI的关键技术参数,建立玉米α-AI的纯化工艺,并对所得玉米α-AI理化性质及动力学进行了初步分析。
1.玉米α-AI提取的研究。
20个玉米品种中筛选出α-AI含量较高的品种作为实验原料。
采用单因素实验研究了提取液、浸提时间、浸提温度、浸提液盐浓度、浸提液pH、浸提液料比、离心机转速等8个因素对玉米α-AI提取率的影响。
通过皮尔逊相关性、方差分析确定出对玉米α-AI提取率影响显著的几个因素,利用二次正交旋转组合试验确定出玉米α-AI的最佳提取工艺参数。
研究结果表明:试验C272玉米品种α-AI含量最高;最佳提取工艺参数为:0.02mol·L<sup>-1</sup>磷酸盐缓冲溶液中,NaCl浓度为0.15 mol·L<sup>-1</sup>,浸提液料比4.3:1,浸提液pH 6.9,浸提时间3.2 h,玉米α-AI的提取率为22.162 AIU·g<sup>-1</sup>,验证实验达到21.996 AIU·g<sup>-1</sup>;硫酸铵在35%～65%饱和度时分离玉米α-AI效果最佳。
2.玉米α-AI分离纯化工艺及其技术参数的优化。
通过对玉米α-AI进一步分离纯化,获得较高纯度的玉米α-AI,并确定了简单可行的纯化工艺技术。
使用DEAE-Sephadex A-25和D301、D315、DCF-5等离子交换介质进行静态吸附试验,确定最适柱材;对洗脱液及洗脱方式、填料高度进行试验,用L9（34）正交试验对填料高度、流速、进样浓度及进样量这四个因素进行最佳试验条件优化,确定最佳分离条件;采用SephadexG-75凝胶过滤对纯化的玉米α-AI进行分离脱盐,最后采用SDS-PAGE、HPLC对α-AI纯度进行鉴定。
酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究
酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究胡元森;潘涛;李翠香【摘要】纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%.酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60 kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5 0,该酶在pH3 4-6 0下稳定,高温耐受性差.Cu~(2+)、Zn~(2+)、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)和Mn~(2+)对酶具有较强的激活作用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)003【总页数】4页(P199-202)【关键词】酸性α-淀粉酶;蛋白纯化;酶学性质【作者】胡元森;潘涛;李翠香【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052;河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052;河南工业大学生物工程学院,河南工业大学粮油重点实验室与工程中心,郑州,450052【正文语种】中文目前,国内外市场中两类常用的淀粉酶为中温和高温α-淀粉酶,其适用 pH范围为6-7,在酸性条件下其酶活性明显降低[1]。
酸性α-淀粉酶在低 pH条件下以随机方式切断淀粉分子内的α-1,4-糖苷键,能满足一些酸性条件下淀粉原料的深加工工艺要求[2]。
此外,酸性α-淀粉酶因其具有在酸性条件下发挥作用的特性,可广泛应用于发酵饮料、青贮饲料、医药等多种领域。
自 1963年日本研究者发现 Aspergillus niger可以产酸性α-淀粉酶以来,许多学者开始对其进行研究。
例如,刘永乐等[3]筛选到一株产酸性淀粉酸的黑曲霉菌株AS-Y,并对其固态发酵条件进行了优化。
陈波等[4]从土壤中分离到一株产酸性α-淀粉酶的青霉菌株,最适作用 pH4.4,最适作用温度为60℃。
土壤中分离产生α-淀粉酶的菌种
微生物学实验设计方案实验名称：土壤中分离产生α-淀粉酶的菌种一．实验目的1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习、掌握微生物的鉴定方法。
3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定并由鉴定结果查伯杰氏手册以确定分离出微生物的品种。
二. 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。
1、采样：即采集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。
在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。
在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。
除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。
例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。
2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。
因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。
3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。
通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
三．实验材料1、器材：小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管（每支4.5mL水）、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、搪瓷杯、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、天平、滤纸、pH试纸等。
白芸豆中减肥药物α淀粉酶抑制剂的提纯及其性质研究
西北大学 硕士学位论文 白芸豆中减肥药物α-淀粉酶抑制剂的提纯及其性质研究 姓名：赵蓉 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：李多伟
20100601
白芸豆中减肥药物Ｑ一淀粉酶抑制剂
的提纯及其性质研究
中文摘要
ａ一淀粉酶抑制剂（ａ—ＡＩ）是一种糖苷水解酶抑制剂。从白芸豆中分离纯化的Ｑ 一淀粉酶抑制剂在医药及农业生产等方面具有广泛地实用价值，尤其在减肥和治疗糖尿 病方面有突出的优点。
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｗｈｉｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｂｅａｎｓ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌｉｎｎ），ａ－－ａｍＬｙａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ａ—ＡＩ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ，ＤＦ）
西北大学学位论文知识产权声明书
白芸豆为一年生擅物，有矮性或蔓性两类。矮性种株高３０～６０厘米，蔓性种株ｌ ６～ ２米。三出复叶，叶腋间抽生总状花序，花对生、白色、蝶形、两性花。喜温暖，不耐 霜冻，也不耐热，为短日照植物，春秋两季均可栽培。我国主要分布在高寒、冷凉干旱 地区，一般产量在１０２０～１１２５ｋｇ／ｈｍ２。
侮捷 隧
图１白芸豆植株
光泽，用作配菜可谓锦上添花，在国内外享有盛名。
第一章文献综述
但是芸豆不宜生食，食用须煮透。因为其籽粒中含有对人有毒的毒蛋白，即植物凝 集素（ＰＨＡ），但它对热呈不稳定性，故食用必须煮熟煮透以消除其毒性，否则会引起 食物中毒【３１。
（２）药用价值 我国古医籍记载，芸豆的籽、果壳、根均可入药。芸豆性味甘、平，具有温中下气、
本文以白芸豆为原料，以Ｑ一淀粉酶抑制剂为研究对象，设计实验对白芸豆中Ｑ一 淀粉酶抑制剂的提取、分离纯化以及其性质、提取下脚料豆渣的综合利用等进行了相应 的研究，并取得了以下成果ｔ
20100601
白芸豆中减肥药物Ｑ一淀粉酶抑制剂
的提纯及其性质研究
中文摘要
ａ一淀粉酶抑制剂（ａ—ＡＩ）是一种糖苷水解酶抑制剂。从白芸豆中分离纯化的Ｑ 一淀粉酶抑制剂在医药及农业生产等方面具有广泛地实用价值，尤其在减肥和治疗糖尿 病方面有突出的优点。
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｗｈｉｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｂｅａｎｓ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌｉｎｎ），ａ－－ａｍＬｙａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ａ—ＡＩ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｉｂｅｒ，ＤＦ）
西北大学学位论文知识产权声明书
白芸豆为一年生擅物，有矮性或蔓性两类。矮性种株高３０～６０厘米，蔓性种株ｌ ６～ ２米。三出复叶，叶腋间抽生总状花序，花对生、白色、蝶形、两性花。喜温暖，不耐 霜冻，也不耐热，为短日照植物，春秋两季均可栽培。我国主要分布在高寒、冷凉干旱 地区，一般产量在１０２０～１１２５ｋｇ／ｈｍ２。
侮捷 隧
图１白芸豆植株
光泽，用作配菜可谓锦上添花，在国内外享有盛名。
第一章文献综述
但是芸豆不宜生食，食用须煮透。因为其籽粒中含有对人有毒的毒蛋白，即植物凝 集素（ＰＨＡ），但它对热呈不稳定性，故食用必须煮熟煮透以消除其毒性，否则会引起 食物中毒【３１。
（２）药用价值 我国古医籍记载，芸豆的籽、果壳、根均可入药。芸豆性味甘、平，具有温中下气、
本文以白芸豆为原料，以Ｑ一淀粉酶抑制剂为研究对象，设计实验对白芸豆中Ｑ一 淀粉酶抑制剂的提取、分离纯化以及其性质、提取下脚料豆渣的综合利用等进行了相应 的研究，并取得了以下成果ｔ
枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究 -回复
枯草杆菌生产α-淀粉酶的研究-回复枯草杆菌生产α淀粉酶的研究引言：淀粉是一种由葡萄糖分子组成的多聚体，是植物细胞中最重要的储能物质。
为了有效地利用淀粉，许多微生物产生了淀粉酶。
淀粉酶能够水解淀粉成为可被微生物利用的单糖，其中α淀粉酶是将淀粉水解成麦芽糖或是葡萄糖的主要酶类之一。
而枯草杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，在许多领域都具有潜在应用价值。
本文将探讨枯草杆菌生产α淀粉酶的研究目的、方法、结果和展望。
目的：本研究的目的是通过培养枯草杆菌，使其表达α淀粉酶，以探索其在产业应用上的潜力。
方法：1. 枯草杆菌菌种的筛选：从不同的土壤样本中筛选出具有较高淀粉酶产量的枯草杆菌菌株；2. 培养基的优化：对枯草杆菌菌株进行不同培养基的筛选和优化，以提高淀粉酶产量；3. 发酵条件的优化：调节发酵条件，包括温度、初始pH、培养时间和淀粉浓度，进一步提高淀粉酶活性；4. α淀粉酶的提取和纯化：通过离心、过滤、浓缩和柱层析等技术，将淀粉酶从菌体中分离提取，并进行纯化。
结果：通过以上的实验步骤和优化条件，我们成功获得了一株高产α淀粉酶的枯草杆菌菌株，并获得了较高的淀粉酶产量。
实验结果表明，枯草杆菌在适宜的发酵条件下能够表达和产生大量的α淀粉酶。
展望：虽然本研究已经取得了一定的成果，但仍然存在一些挑战和改进的空间。
首先，我们可以进一步优化发酵条件，以提高淀粉酶产量。
其次，可以通过基因工程手段改良枯草杆菌的基因组，提高其淀粉酶产量和活性。
此外，可以进一步研究α淀粉酶的性质和机制，以在其应用领域发挥更大的作用。
结论：本研究通过对枯草杆菌的研究，成功实现了α淀粉酶的生产。
这为淀粉酶的产业化应用提供了新的途径和可能性。
枯草杆菌生产α淀粉酶具有较高的生物安全性和可行性，且可以通过合理优化发酵条件和基因工程手段，进一步提高产量和活性。
通过深入研究淀粉酶的性质和机制，有望在食品加工、饲料行业和生物能源领域等方面发挥重要作用。
总结：枯草杆菌是一种潜在的产α淀粉酶的微生物菌株。
α-淀粉酶的分离提纯
α- 淀 粉 酶 的 分 离 方 法 的 比 较 α-淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。目前工 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途。 淀粉酶在食品工业上有着广泛的用途 业上从发酵液中提取α淀粉酶的方法多 淀粉酶的方法多。 业上从发酵液中提取 淀粉酶的方法多。 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝-超滤 超滤-乙醇 主要有直接用硫酸铵沉淀和采用絮凝 超滤 乙醇 沉淀方法 。 种方法食品工业上不能使用。 第一 种方法食品工业上不能使用。 第二种方法要求发酵液澄清度好， 第二种方法要求发酵液澄清度好，否则超滤膜堵 此外超滤法浓缩酶液是有限度的， 塞， 此外超滤法浓缩酶液是有限度的，沉淀仍消 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在55%左 耗大量的乙醇同时酶的回收率也较低一般在 左 右。 为了提高产品的活性,酶活性的回收和减少乙醇的 为了提高产品的活性 酶活性的回收和减少乙醇的 用量已有相关报道用大孔吸附树脂吸附的方法分 离纯化α- 淀粉酶 。在此进一步改进了洗脱方式， 离纯化 在此进一步改进了洗脱方式， 使其更便于工业化生产， 使其更便于工业化生产，使用离子交换的方法进 一步纯化α- 淀粉酶。 淀粉酶。 一步纯化
吸附树脂法发酵液cacl加水溶解加入絮凝剂搅拌压滤收集滤液滤液中加入吸附树脂过滤弃去滤液收集吸附树脂收集滤液40的乙醇过滤5乙醇成品收集沉淀沉淀无水乙醇洗脱ph为650005mollph为6502mollph为6505moll反复洗涤de32处理好的de32转入烧杯过夜制3cm4cm的层析柱2mlmin的流速平衡2h2mlmin洗脱酶液得洗脱峰1收集洗脱液测酶活性2mlmin洗脱酶液得洗脱峰2收集洗脱液测酶活性称取树脂吸附淀粉酶1g10ml注意
出峰图
注意！！！
–N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经 皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮 肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无 毒物质。沉淀α-淀粉酶过夜 α
生物化学实验
生物化学实验
-
1
α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
2
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
3
α-淀粉酶的研究现状
生物化学实验
α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖 葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液 化酶、α-1，4-糊精酶。黄褐色固体粉末 或黄褐色至深褐色液体，含水量5%~8%。 溶于水，不溶于乙醇或乙醚
α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
具有反应速度快、效率高、成本低等优势
2
α-淀粉酶分离 提纯的研究历史
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉 (Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水 浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲600单位 以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经 薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、 麦芽四糖分别占6.4%、32.3%、37.1%、10.9% 米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低， 避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包 发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂
1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄 糖工艺的研究
与传统的酸法相比可以提高收率10%，降 低成本15%以上
1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶 生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7%~10%， 提高出糖率10%左右
1979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺 的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风 制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用， 取得了良好的经济效益
另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸 发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、 酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功 并投入生产
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α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
2
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
3
α-淀粉酶的研究现状
生物化学实验
α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖 葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液 化酶、α-1，4-糊精酶。黄褐色固体粉末 或黄褐色至深褐色液体，含水量5%~8%。 溶于水，不溶于乙醇或乙醚
α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
具有反应速度快、效率高、成本低等优势
2
α-淀粉酶分离 提纯的研究历史
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉 (Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水 浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲600单位 以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经 薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、 麦芽四糖分别占6.4%、32.3%、37.1%、10.9% 米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低， 避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包 发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂
1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄 糖工艺的研究
与传统的酸法相比可以提高收率10%，降 低成本15%以上
1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶 生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7%~10%， 提高出糖率10%左右
1979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺 的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风 制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用， 取得了良好的经济效益
另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸 发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、 酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功 并投入生产
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α-淀粉酶分离提纯技术研究进展摘要：为了更好地研究α-淀粉酶的性质与应用α-淀粉酶，我们需要不断地从不同的生物体内提取α-淀粉酶并将其高纯化。
随着生物技术的不断发展，分离提纯的方法也越来越复杂越精确，然而它却为生物学的发展奠定了一定的基础，此篇综述简要地说明近年来国内外在α-淀粉酶的分离纯化等方面成就，也部分介绍了α-淀粉酶的研究现状和工业应用以及发展前景。
关键字：α-淀粉酶分离提纯现状应用前景α-淀粉酶(α-Amylase)是一种内切葡萄糖苷酶，属于淀粉酶。
米黄色、灰褐色粉末。
能水解淀粉中的α-1,4,葡萄糖苷键，在催化水解α-1,4-糖苷键只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。
能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。
作用温度范围60-90℃，最适宜作用温度为60-70℃，作用pH值范围5.5-7.0，最适pH值为6.0。
Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。
主要存在于人的唾液和胰脏中也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。
一、α-淀粉酶分离提纯的研究历史与现状1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉(Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲 600单位。
用硫酸铵分段沉淀，Sephadex G一75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化，经PAGE 鉴定为一条带。
以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖分别占6.4％、32.3％、37.1％、10.9％。
麦芽糖和麦芽三糖二者之和占69.4％,与Novo公司Norman报道的相似，属糖化型α-淀粉酶，可用于制糖、啤酒和面包食品工业，并可以替代一淀粉酶生产麦芽糖浆。
米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低，避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂。
1992年姜涌明等采用壳聚糖絮凝、淀粉吸附、乙醇沉淀等步骤，从枯草芽孢杆菌86315发酵液中提取了α-淀粉酶。
然后用Sepbadex G一100凝胶过滤、DEAE—纤维素柱层析进一步提纯，得到DISC-电泳一条带的淀粉酶制剂，从而更好地研究其动力学问题。
1994年西北大学李汉、李华儒等率先开发了一个用强阴离子高效液相色谱分离纯化α-淀粉酶的新方法，在给定的条件下纯化工业α-淀粉酶，其活性回收率达96％，比活性为388u／mg蛋白质．纯化倍数提高30倍，经SDS-PAGE分析，得到分子量分别为58K和33K两条α-淀粉酶谱带。
此法纯化α-淀粉酶简单、快速、救率高，不仅能纯化工业粗酶，也可纯化其它来源的α-淀粉酶。
在当时，此法的研究成功为大规模制备高纯度α-淀粉酶提供了一个新工艺路线。
在1995年时，唐梓进、肖俊方等针对工业α-淀粉酶常混有其他酶类的问题，改良了淀粉微球亲和吸附纯化α-淀粉酶的方法，将淀粉做成网状结构微球，作为亲和吸附载体，装柱后用于吸附、纯化淀粉酶。
此球机械强度大，对酶吸附量高达125mg／mL床体积。
低温条件下(4℃)操作，球与酶很少反应，重复操作9次未见明显变化。
工业生产较纯的酶经一次过柱后，酶比活仍提高2.3倍，每克干粉酶活提高16.5倍。
整个操作过程简单、方便，酶失活很少，过柱后回收率高达91.6％。
此球既适用于工业生产中纯化淀粉酶，也适用于实验室中淀粉酶的纯化及分析；淀粉球对淀粉酶吸附及解吸时pH值和离子强度的改变、酶本身构象变化的研究，又能为酶与底物间相互作用提供理论依据。
2004年景娟等再次对不同龋敏感者唾液α-淀粉酶的研究，采用XDF-SGM 型疏水柱，通过疏水色谱技术来分离提纯唾液α-淀粉酶，取得了满意的效果。
2005年复旦龚振华等教授通过醋酸纤维薄膜电泳，将正常人血清和PBM患者胆汁和血清中淀粉酶初步分离提纯，继经等电聚焦和SDS-PAGE二位电泳，得到纯化淀粉酶同工酶，并测定其Mr和等电点。
2006年，河南科学院生物研究所刘仲敏等以米曲霉ZLF13菌株经固态发酵生产的真菌粗α-淀粉酶制品(发酵曲)为原料，对其提纯、精制的工艺条件和保存方法进行了研究。
其最佳提纯工艺条件为:培养好的发酵曲采用40°C温水，pH值7.5左右，加水比为 1:4，浸泡3 h，压滤滤液经超滤浓缩后，在 10一15°C ,pH 6.0-6.5，与食用酒精混合为酒精体积分数为70%的溶液中静置沉析，过滤后于40℃低温鼓风干燥。
最采用该工艺条件进行粗酶提纯产品综合回收率稳定在70%以最高达到74%，产品酶活力最高达25416u/g，平均达16608u/g。
同年，湖南农业大学喻凤香等对根霉RhizopusRA-1淀粉酶进行了分离纯化，经过(NH4)2SO4分步沉淀，DEAE-纤维素离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析等3步纯化，达到了电泳纯的液化型淀粉酶带，效果极佳。
2007年，集美大学郭彩华等对进行了鲢肠道部分性质研究，采用硫酸铵沉淀、阴离子交换、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，首次分离纯化鲢肠道淀粉酶。
目前酶的分离提纯技术日益成熟，酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。
以下是一些概括：细胞破碎:机械破碎法(捣碎、研磨、匀浆等)、物理破碎法(温度差、压力差、超声波等)(多用于微生物)、化学破碎法(使用甲苯、丙酮、氯仿等有机溶剂以及特里顿、吐温等表面活性剂)和酶促破碎法等等。
酶的提取:使用盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂等沉淀分离:盐析沉淀.等电点沉淀.有机溶剂沉淀.复合沉淀.选择性变性沉淀离心分离：注意:离心机、离心方法、离心条件等。
过滤与膜分离:非膜过滤(粗滤、部分微滤)、膜过滤（大部分微滤、反渗透、透析、电渗析、）。
层析分离:吸附、分配、离子交换、凝胶、亲和、层析聚焦等。
电泳分离:纸电泳.薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦等。
萃取分离:有机溶剂、双水相、超临界、反胶束等。
浓缩结晶:盐析、有机溶剂、透析、等电点、温度差、金属离子等。
干燥成品:真空、冷冻、喷雾、气流、吸附等。
二、α-淀粉酶的研究现状国内α-淀粉酶类的生产和应用 1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF-7658生产α-淀粉酶，当时只有无锡酶制剂厂独家生产。
1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7％～10％，提高出糖率10％左右。
1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。
l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。
与传统的酸法相比可以提高收率10％，降低成本15％以上。
另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功并投入生产。
国外α-淀粉酶研究现状目前，除开展大量常规诱变育种工作外，国外已初步搞清了产α-淀粉酶的调控基因，探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。
将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株，使一淀粉酶产量提高7～10倍，并已应用于食品和制酒工业，给选育高产α-淀粉酶菌株开创了新的途径。
国内外研究机构及其主要研究方向由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究α-淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究α-淀粉酶的变性机理以及环境对α-淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究α-淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种α-淀粉酶生产菌的α-淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。
国外有代表性的研究单位有：加拿大的University of British Columbia，他们对人胰腺的α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦Carlsberg实验室主要研究大麦α-淀粉酶结构域与结合位点；美国的Western Regional Research Center主要研究大麦的α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦α-淀粉酶的活性位点。
三、α-淀粉酶的工业应用与前景①面包焙烤工业，作为保鲜剂。
②淀粉的液化作用和糖化作用，α-淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。
由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。
这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α-淀粉酶淀粉酶。
③纤维脱浆，淀粉脱浆可以利用α-淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。
④造纸工业，淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。
自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用α-淀粉酶部分降解淀粉来调节。
⑤除垢剂中的应用，酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。
α-淀粉酶从1975年就被应用于洗衣粉。
α-淀粉酶对Ca2+过于敏感，在低Ca的环境下稳定性很差，这限制了α-淀粉酶在除垢剂中的应用。
并且，大多数野生型菌株所产生的α-淀粉酶对作为除垢剂原料之一的氧化剂也过于敏感。
除家用除垢剂中，这个局限可以通过增加一些工艺步骤得到改善。
最近，两家主要除垢剂酶的生产厂家Novozymes and Gcncncore International已经利用蛋白质工艺改善淀粉酶的漂白稳定性。
他们用亮氨酸替代地衣芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白第197位上的蛋氨酸，导致酶对氧化剂成分的抵抗能力大大增强，提高了其氧化稳定性，使酶在储存过程中的稳定性更好。
⑥制药和临床化学分析，随着生物工程的不断发展，淀粉酶的应用涉及到许多其他领域，比如临床，制药和分析化学。
α-淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。
对于高效的α-淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通过蛋白质工艺改良得到。
得益于现代生物技术的发展，α-淀粉酶在制药方面的重要性日益凸显。
当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，α-淀粉酶在这些领域的需求仍然是最大的。