离子交换法用于淀粉酶的分离纯化

第一章淀粉基础理论一、填空题1、淀粉是由单一类型的(糖单元)组成的(多糖),而与淀粉的来源无关。

2、淀粉的分子式为((C6H10O5)n),严格的分子式为(C6H12O6(C6H10O5)n)。

3、淀粉主要是由(直链淀粉)和(支链淀粉)两级分组成。

根据分离分级技术的进步,淀粉还分出(中间级分),一般称为(支化较少的支链淀粉或轻度支化的直链淀粉)。

4、一般直链淀粉的分子量为(5~20万),支链淀粉分子量要比直链淀粉大得多,大约为(20~600)万。

6、直链淀粉分子呈(螺旋)结构。

直链淀粉与碘和脂肪酸的不是(化学)反应,而是形成了(螺旋)包合物。

7、直链淀粉呈右手螺旋结构,每六个葡萄糖单位组成螺旋的每一个节距,螺旋上重复单元之间的距离为1.06nm。

二、简答题1、什么是淀粉淀粉是由单一类型的糖单元组成的多糖,而与淀粉的来源无关.2、轻度分支直链淀粉分子与直链淀粉中的支链淀粉分子的不同点:支链淀粉的相对分子质量要比轻度分支直链淀粉分子大;前者分解极限40%左右,比支链淀粉55%~60%低;温度升高前者先溶出,支链淀粉最后被溶出。

3、淀粉遇碘产生蓝色反应,这种反应是什么反应?这种反应不是化学反应,而是呈螺旋状态的直链淀粉分子能够吸附碘形成螺旋包含物。

4、什么叫淀粉颗粒的偏光十字?什么叫淀粉颗粒的结晶化度?偏光显微镜观察下淀粉颗粒呈现黑色的十字,将淀粉颗粒分成4个白色区域称为偏光十字。

淀粉颗粒构造可以分为以格子状态紧密排列着的结晶态部分和不规则地聚集成凝胶状的非晶体部分,结晶态部分整个颗粒的百分比,称为结晶化度。

5、什么是淀粉的糊化?什么是淀粉的糊化温度?若把淀粉的悬浮液加热,达到一定温度淀粉颗粒突然膨胀,体积达到原来体积的百倍之大,所以悬浮液变成粘稠的胶体溶液,这现象称为淀粉的糊化。

淀粉颗粒突然膨胀的温度称为糊化温度。

6、什么是淀粉的回生?淀粉稀溶液或淀粉糊在低温下静止一段时间浑浊度增加,溶解度减少,在稀溶液中会有沉淀析出,如果冷却速度快。

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。

关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂的提取及性质研究刘晓洁;刘同祥;张宗申【期刊名称】《时珍国医国药》【年(卷),期】2011(22)7【摘要】目的从鹰嘴豆中分离纯化得到α-淀粉酶抑制剂(α-AI),研究其抑制动力学特征及其化学稳定性,为其开发为降糖减肥药物提供依据。

方法采用硫酸铵分级沉淀、CM-52纤维素离子交换柱层析及凝胶柱层析分离纯化α-AI;通过在不同底物及抑制剂浓度下的酶反应速度,研究其抑制动力学特征;通过在不同温度及pH条件下的抑制活性,研究其对温度及pH的稳定性。

结果纯化得到一相对分子质量约为40.4 Da的α-AI糖蛋白,其对α-淀粉酶的抑制为非竞争性抑制,抑制常数Ki=3.14×10-6mol.L-1;鹰嘴豆α-AI在pH3.0～11.0,在80℃下作用30 min后其抑制活性仍保持85%左右。

结论从鹰嘴豆中分离得到的α-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶具有较高的抑制活性,对温度及pH具有较高的稳定性,其作为一种安全、天然降糖药物具有良好的开发前景。

【总页数】3页(P1580-1582)【关键词】α-淀粉酶抑制剂;鹰嘴豆;提取【作者】刘晓洁;刘同祥;张宗申【作者单位】大连工业大学生物工程学院;中央民族大学中国少数民族传统医学研究中心【正文语种】中文【中图分类】R283【相关文献】1.鹰嘴豆中α-淀粉酶抑制剂抗氧化特性研究 [J], 郝小燕;崔竹梅;麻浩;顾爱星2.鹰嘴豆种子发芽和成熟过程中α-淀粉酶抑制剂的活性研究 [J], 郝小燕;顾爱星;刘众悦;麻浩3.白豆中α-淀粉酶抑制剂的提取及其酶学性质的研究 [J], 杨秀芳;吴明鑫;刘晓桓4.紫冠豆角(Phaseolus vulgaris L.)种子中α-淀粉酶抑制剂的提取及其性质研究[J], 孙庆申;朱国庆;王璇;冯国军;宋永5.鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究 [J], 刘晓洁;刘同祥;张宗申因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37C,24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

酶的分离纯化技术及进展摘要：随着工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题，本文介绍了沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等常规方法和反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等新型技术在分离纯化酶的应用。

此外，随着对工业用酶要求的提高，常规方法和新颖方法的结合也为分离纯化酶提供了高效的分离纯化效果。

关键词：酶分离技术生物分离一.引言酶作为生物催化剂，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等催化特点,在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领域有着广泛的应用[1]。

大多数工业用酶都由微生物发酵得到，且随着发酵技术的优化已能成功进行大规模生产。

随着蛋白类临床治疗药物和工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题。

酶的分离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开而获得与使用目的要求相一致的有一定纯度的酶产品的过程。

常规的微生物酶分离纯化方法有沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等，新兴的分离技术，如反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等在分离纯化酶的应用上也取得了一定进展。

此外，利用常规方法和新颖方法相结合的分离技术为分离纯化酶提供了新的方法。

二.分离纯化酶的常规方法纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的位置和次序，为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及分离次序的选择也至关重要。

一般的分离次序遵循以下原则：将含量较多的杂质用尽量简单且经济的方法先分离出去，如沉淀、过滤和吸附；将费时又昂贵的工艺放在最后阶段。

因此在分离纯化酶之前通常需要对发酵液进行预处理，对于胞外酶，发酵液经离心或过滤除掉细胞,上清液用超滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂抽提等方法浓缩；胞内酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用硫酸铵沉淀的浓缩方法。

α-淀粉酶分离提纯技术研究进展摘要：为了更好地研究α-淀粉酶的性质与应用α-淀粉酶，我们需要不断地从不同的生物体内提取α-淀粉酶并将其高纯化。

随着生物技术的不断发展，分离提纯的方法也越来越复杂越精确，然而它却为生物学的发展奠定了一定的基础，此篇综述简要地说明近年来国内外在α-淀粉酶的分离纯化等方面成就，也部分介绍了α-淀粉酶的研究现状和工业应用以及发展前景。

关键字：α-淀粉酶分离提纯现状应用前景α-淀粉酶(α-Amylase)是一种内切葡萄糖苷酶，属于淀粉酶。

米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1,4,葡萄糖苷键，在催化水解α-1,4-糖苷键只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60-90℃，最适宜作用温度为60-70℃，作用pH值范围5.5-7.0，最适pH值为6.0。

Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。

主要存在于人的唾液和胰脏中也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。

一、α-淀粉酶分离提纯的研究历史与现状1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉(Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲 600单位。

用硫酸铵分段沉淀，Sephadex G一75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化，经PAGE 鉴定为一条带。

以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖分别占6.4％、32.3％、37.1％、10.9％。

麦芽糖和麦芽三糖二者之和占69.4％,与Novo公司Norman报道的相似，属糖化型α-淀粉酶，可用于制糖、啤酒和面包食品工业，并可以替代一淀粉酶生产麦芽糖浆。

α-淀粉酶的固定化实验若干问题α-淀粉酶的固定化实验若干问题本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。

吸附法有物理交换法和离子交换法两种。

其中本实验采用的又是物理交换法。

该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。

自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。

现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

为什么要待固定化酶柱中流出5mL液体后再接收流出液用于鉴定？因为固定化酶柱中的酶与流经柱子的淀粉反应需要一定的时间，刚开始流出的液体中由于反应时间过短（在反应柱中快速流入），糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的颜色鉴定。

如何理解α-淀粉酶的固定化亲和层析洗脱液选修1教材中出现了“亲和层析洗脱液”，通过对照实验来确定糊精的产生，（1）淀粉溶液+指示剂：呈蓝色，（2）亲和层析洗脱液+指示剂：呈红色，贮于冰箱几天后重复实验：呈红色。

而我们实验在操作过程中并没有用到“亲和层析洗脱液”，我在想是不是这样的操作实验更明显？洗脱的作用是洗脱糊精，让实验更明显？首先要明确石英砂的吸附原理：石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。

由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。

被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。

其次要明确亲和层析法的原理：生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如抗原与抗体，酶与底物或抑制剂，激素与受体等，这种结合往往是专一的而且是可逆的，生物分子间的这种结合力称为亲和力，亲和层析的分离原理简单地说就是通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性的基质（也称载体）上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。

酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。

现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。

关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。

酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。

一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。

酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。

正文：1. 酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。

酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2. 酶的分离纯化 2.1 细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。

1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。

捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。

常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。

此法在实验宝和生产规模均可采用。

研磨法：用研钵直接研磨。

常用于微生物的微生物材料的破碎。

匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。

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