分离产淀粉酶的芽孢杆菌要点

题目产淀粉酶的活性芽胞杆菌的分离、鉴定与育种摘要首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行微波诱变，筛选出产量高、性状优良的正突变菌株，并用正交实验的方法，从发酵培养基三个主要成分（玉米粉、黄豆饼粉、酵母粉）对产酶条件进行优化，实验最后利用多相分类的方法对筛选出的正突变菌株做了菌种鉴定，初步确定为短芽孢杆菌。

引言淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途[1]。

现在淀粉酶主要来源于植物和微生物[2]并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事[3]。

本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。

一、研究方法1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。

诱变箱：微波炉（E30E-3）离心机、721分光光度计：3、培养基和试剂（1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基[4、7]、出发培养基[4、7]、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基（2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸（注：所用药品均为分析纯）。

4、实验方法（1）细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的H/C值[5]。

从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、摘要本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。

二、实验目的及要求1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。

4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。

三、实验仪器设备主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液四、实验方案设计（一）实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。

2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌5、在含有淀粉鉴定培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色（二）培养基成分蛋白胨5gNaCl 5g可溶性淀粉16g蒸馏水1000ml琼脂20g（葡萄糖 1.5g 芽孢萌发时加葡萄糖以利生长）五、实验内容及步骤（一）产淀粉酶菌株的分离1．样本采集在花园土壤肥沃处采取土样，取25g加入225ml无菌水制成土壤混悬液。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。

实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。

2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。

3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。

4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。

适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。

一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。

5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。

可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。

6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。

7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。

一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。

根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。

8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。

可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。

9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。

实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。

2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。

3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。

4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。

5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。

总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。

这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定试验一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。

4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。

二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽抱杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、芽抱是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽抱最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽抱，再在80-90 C温度下杀死菌体，可使芽抱得到富集。

4、芽抱杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25C到75C以上；最低生长温度大约5C到45C；生长最低pH值，从一8到2左右；耐盐范围从低于2%勺NaCI到25%NaC；营养明胶(22°C) 7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。

5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽抱杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。

关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。

其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。

α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。

芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。

芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。

例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。

此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。

笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。

1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。

产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。

2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。

而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。

3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。

有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。

由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。

因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。

如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。

5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。

而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。

实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。

调整PH至7.4到7.6。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、摘要自然界中的绿色植物通过光合作用的最终产物为淀粉，当叶落时，可以被土壤中的微生物分解。

这是微生物通过产生胞外淀粉酶而导致的结果。

要从土壤之中分离产淀粉酶的芽孢杆菌，便可以通过在含有淀粉的培养基上培养，分离、纯化微生物，从而通过观察微生物消耗的淀粉而形成的淀粉水解圈，加碘液后观察。

而芽孢是微生物的一种休眠体，可以被染色，通过显微镜观察。

通过以上过程便可分离出所需的微生物。

二、实验目的及要求1、通过自主性试验，了解掌握微生物分离、纯化的一般步骤。

2、熟练掌握微生物分离的各种技术与方法，及实验过程中所要注意的一般事项。

三、实验仪器设备试管（加入435mL水）5支培养皿13个移液管（1ML）5支接种耙4个玻璃棒若干载玻片若干酒精灯接种针搪瓷缸2个灭菌箱培养箱无菌操作台显微镜电子秤电磁炉牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3克蛋白胨10克Nacl 5克琼脂15克水1000mL pH 7.0~7.2淀粉培养基：牛肉膏2克蛋白胨10克Nacl 5克琼脂15克水1000 mL 可溶性淀粉5克孔雀绿试剂蒸馏水95﹪的酒精结晶紫试剂卢格氏试剂四、实验方案设计（一）实验原理淀粉遇碘变蓝，所以当生长在平板上的单菌落若能产生胞外淀粉酶，分解培养基中的淀粉，则当菌落周围滴加卢格氏试剂时，由于淀粉被水解，则不会变蓝，而远离菌落的培养基上则会由于仍有淀粉而变蓝从而形成淀粉水解圈，以此来鉴定是否该微生物们能够产生淀粉酶。

对于芽孢来说，由于芽孢不易染色，但是一旦染色布很不容易洗去的原理。

用孔雀绿染色后，可是微生物变绿，水洗后，可以洗去微生物非芽孢成分的绿色，再用蕃红染色，可是细菌变红，从而清晰的观察微生物的形状和是否产生芽孢。

（二）实验过程设计1、培养基的配制按以上配方配制牛肉膏蛋白胨培养基300mL，淀粉培养基200mL。

方法：按配方称取药品放入加入少量水的搪瓷缸中，用玻璃棒搅匀，在电磁炉上加热，煮沸并维持沸腾，最后补足水，倒入锥形瓶内2、对所用仪器的包扎试管（加入435mL水）5支培养皿13个移液管（1ML）5支接种耙4个装有90mL 的水并带有玻璃珠的锥形瓶进行包扎3、对以上的培养基、仪器进行灭菌4、微生物的培养（1）对灭菌后的培养皿底部贴上标签，标明培养基及名称和组别，在超净工作台中倒9个牛肉膏蛋白胨培养基和四个淀粉培养基，然后放置几分钟凝固，然后倒置，放在37℃的培养箱中培养24小时，观察是否有菌落生长，若无，则可以用;若有，则需重新配制培养基。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案报告实验方案报告：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、实验目的：本实验旨在从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供材料基础。

二、实验原理：产淀粉酶的芽孢杆菌主要存在于土壤中，它们具有高效分解淀粉的能力。

本实验通过稀释土壤样品，制备土壤悬浮液，然后采用平板和液体培养基法进行分离纯化。

三、实验步骤：1.土壤样品的采集2.土壤样品制备将土壤样品采样袋中的土壤倒入无菌的研钵中，使用无菌铁锹将土壤表面的杂质去除，然后将土壤样品与等量无菌蒸馏水混合浸泡2小时。

使用无菌玻璃棒搅拌1分钟，然后过滤土壤悬浮液，得到土壤样品的0.1倍稀释液。

3.平板培养基分离将制备好的土壤样品0.1倍稀释液分别取0.1mL均匀涂布在含有淀粉的固体培养基平板上，用无菌的铁锹均匀摊开。

将培养皿倒立放置在培养箱中，以30℃恒温培养。

4.鉴定单菌菌落在培养平板上观察菌落生长情况，挑选形态不同的菌落，并进行分离培养。

将单个菌落挑选到含有淀粉的液体培养基中，用无菌胶头移液管进行吸取和移植。

5.验证淀粉酶活性将挑选分离得到的菌株分别接种在含淀粉的液体培养基中，并进行培养。

通过观察培养基颜色的变化、液体浑浊度的变化以及淀粉浓度的定量检测，判断菌株产淀粉酶的能力。

四、实验结果：根据实验步骤所述，从土壤中成功分离得到了产淀粉酶的芽孢杆菌。

通过观察培养基的颜色变化和液体浑浊度的变化，可以初步判断杆菌产淀粉酶的能力。

五、实验讨论与结论：通过本实验的步骤操作，成功分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。

该实验为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供了材料基础。

此外，实验中还可以对分离得到的菌株进行基于16SrRNA基因的鉴定，对其进行淀粉酶的基本特性、产酶条件和产酶规律等方面的研究。

这对于我们深入了解淀粉酶功能机制，以及在饲料、食品、生物工程等领域的应用具有重要意义。

六、实验心得：通过本次从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌的实验，我学会了土壤样品的制备和分离培养的方法，掌握了菌株的挑选和鉴定技巧，对淀粉酶产生的条件和酶活性的检测有了初步了解。