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产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定王磊;陈宇飞;杨柳【摘要】从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定.结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4U/mL~10.4 U/mL之间.经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌.%The amylase-producing strains were isolated from soil. After initially screening by starch culture medium, the DNS method was used to determine the total enzyme activity andα-amylase activity of the crude enzyme solution by fermentation extraction. The screened strains were identified through morphological observa-tion and physiological and biochemical reactions. Results showed that:four strains of amylase-producing Bacil-lus were isolated. The ratio of hydrolysis zone diameter to colony diameter was 1.7-3.5. Two strains of them had high amylase-producing activity, which the total enzyme activity reached 19.760 U/mL and 15.432 U/mL. Theα-amylase activity of four strains of Bacillus was 6.4 U/mL~10.4 U/mL. The four strains of Bacillus were authen-ticated that one was Bacillus subtilis, the other three were Bacillus cereus. The ability to produce amylase of Bacillus subtilis was superior to Bacillus cereus.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】4页(P175-178)【关键词】芽孢杆菌;淀粉酶;分离;鉴定【作者】王磊;陈宇飞;杨柳【作者单位】吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507【正文语种】中文淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，是最早实现工业化生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究土壤是微生物的自然栖息地，其中存在着大量的微生物群体。
其中，淀粉酶微生物是土壤中的一种重要群体。
淀粉酶微生物可以利用土壤中的淀粉为能源，将淀粉水解成葡萄糖等单糖，为土壤中的其他微生物提供了能量。
此外，淀粉酶微生物还能够分解淀粉质的残留物，促进土壤的有机质分解，有助于土壤肥力的提高。
因此，分离纯化土壤中的淀粉酶微生物对于了解土壤微生物群体的结构和功能，以及发掘土壤微生物资源具有重要意义。
本文将从土壤中分离淀粉酶微生物的方法、淀粉酶微生物的特性以及淀粉酶微生物的应用等方面进行探讨。
一、土壤中分离淀粉酶微生物的方法土壤中淀粉酶微生物的分离是一个相对复杂的过程。
一般来说，可以采用筛选法、培养法、分子生物学技术等方法。
筛选法是一种最常用的土壤淀粉酶微生物分离方法。
其原理是利用淀粉为唯一碳源，在含有淀粉的培养基上筛选出淀粉酶微生物。
具体操作步骤为：将土壤样品通过筛网筛选后，制备不同浓度的稀释液，分别接种到含有淀粉的培养基上，进行培养。
待出现淀粉水解圈后，将圈内菌落进行分离、筛选，最终获得淀粉酶微生物。
培养法是通过将土壤样品接种到含有淀粉的液体或固体培养基中，利用淀粉为唯一碳源，诱导淀粉酶微生物生长和繁殖。
培养法的优点是可以获得纯种菌株，但是其缺点是存在一定的选择性，不能完全反映土壤微生物群体的整体结构。
分子生物学技术是一种新型的土壤微生物分离方法。
其原理是通过对土壤样品中微生物的DNA序列进行分析，筛选出含有淀粉酶基因的微生物。
该方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，但其操作难度较大，需要专业技术支持。
二、淀粉酶微生物的特性淀粉酶微生物是一类能够分解淀粉的微生物群体。
淀粉酶微生物广泛存在于土壤中，并具有以下特性：1.多样性。
淀粉酶微生物包括细菌、真菌、放线菌等多种微生物群体，具有较高的多样性。
2.分解效率高。
淀粉酶微生物能够高效地将淀粉水解为葡萄糖等单糖，其分解效率高于一般的微生物群体。
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。
2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。
3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。
有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。
因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。
5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。
而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。
实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。
调整PH至7.4到7.6。
产淀粉酶菌株的筛选实验报告一、实验背景淀粉酶是一种常见的酶，广泛存在于微生物和植物中。
淀粉酶能够水解淀粉分子，将其分解成糖类分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
淀粉酶广泛应用于食品、医药、环保等领域中。
制备高效的产淀粉酶菌株，对实现产业化生产具有重要意义。
二、实验目的通过筛选不同菌株的淀粉酶产量，选出产淀粉酶效果较好的菌株，为后续工业化生产提供依据。
三、实验步骤及方法1. 菌株的选取本实验选取了3株常见的淀粉酶产生菌株，分别为Bacillus subtilis、Aspergillus niger、Trichoderma reesei。
2. 菌株的培养将3株菌株接种到琼脂培养基中，经过静置培养后，选取菌落较为圆润、生长状态良好的菌落，移植至含有淀粉质的液体培养基中，进行淀粉酶产量的筛选实验。
3.淀粉酶活性的测定分别取3组接种液，以葡萄糖和淀粉为基质，分别加入菌液，进行淀粉酶活性测定。
具体步骤如下：(1)准备含1%淀粉质的液体培养基和0.5%葡萄糖液体培养基。
(2)将接种液投入含1%淀粉质的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入 1%伊红色溶液备用。
(3)将接种液投入含0.5%葡萄糖的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入1%伊红色溶液备用。
(4)通过比较加入菌液前后溶液颜色的深浅，计算出淀粉酶的酶活力。
4. 结果记录及分析根据上述实验步骤，在不同的液体培养基中测定了3株菌株的淀粉酶活性，并记录结果如下表所示：表1.不同菌株的淀粉酶活性| 菌株名称 | 淀粉酶酶活力 || ------------------ | --------------- || Bacillus subtilis | 0.19 U/mL || Aspergillus niger | 0.21 U/mL || Trichoderma reesei | 0.23 U/mL |根据上表结果可以看出，3株菌株在淀粉酶产量方面的效果有所不同。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等a-1,4-葡聚糖，水解a l, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为a淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与禺淀粉酶（EC 3. 2. 1.2.）。
a-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；3■淀粉酶与a-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断a1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘署、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1,2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp.，Strepiococcus boris Bacillus circulans，Chalara paradoxa 等菌种均有产淀粉酶能力。
本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm 土层取土壤样品中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定[8]。
同时，拟进行发酵条件的优化以提高菌株的酶产量，分离提纯产生的淀粉酶并进行酶活力测定，为利用该菌株进行工业化生产淀粉酶提供初步的理论依据。
1.材料和方法1.1实验材料1.1.1分离材料种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm 土层取土壤样品。
1.1.2培养基(1 PDA固体培养基[9]:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL。
pH5.5~6.5 之间，121 T 灭菌20 min。
(2平板筛选培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g , NaCI 5g,可溶性淀粉20g，琼脂15~20g, pH 自然，121 C灭菌20 min。
(3发酵培养基[10]:蛋白胨10g，牛肉膏5g , NaCl 10g, pH 7.0, 121 C灭菌20 mi n。
(4 LB培养基: 蛋白胨10g，酵母膏5g , NaCl 10g，琼脂20g , pH自然，121 C 灭菌20 mi n。
1.1.3主要试剂配制DNS试剂[11]:酒石酸钾钠18.2g ,溶于50mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸0.03g , NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，室温保存。
CTAB法所用主要试剂：提取缓冲液：2 CTAB提取液(2%CTAB , 200 mmol/L Tris-HCI (pH8.0, 50 mmol/L EDTA(pH8. 0, 1.4 mol/L NaCl ); 10 >CTAB 提取液(10%CTAB, 0.7 mol/L N aCl ; TE 缓冲液:100 mmol/L T ris-HCl (pH8.0 , 10 mmol/L EDTA (pH8.0。
电泳缓冲液：取50X TAE (242 g Tris碱和57.1 mL冰乙酸溶于100 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH8.0溶液中，加去离子水至1000 mL) 20 mL加蒸馏水至1000 mL；溴化乙锭(EB :称取5 g溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB，溶于蒸馏水中并定容到10 mL ,避光保存。
临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍，使其最终浓度达到0.5卩g/n；1.0%的凝胶：称取琼脂粉1.0 g,加热使之溶于100 mL的电泳缓冲液，加入5卩L EB混匀。
氨苄青霉素(Ampicillin )(100 mg/mL):溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL。
分装成小份于-20°C贮存。
以50卩g/ml的浓度添加于生长培口养基。
大肠杆菌质粒提取相关试剂：溶液I: 50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HCI(pH8.0 , 10mmol/L EDTA ;溶液II : 0.2 mol/L NaOH，1%SDS混合液(使用前新配制；溶液III : 5 mmol/L KAc溶液pH 4.8;去离子水：双蒸水灭菌得到；酚:氯仿:异戊醇(25:24:1);无水乙醇；75%的乙醇。
克隆相关试剂0.05 mol/L CaCl2溶液；含15%甘油的0.05 mol/L CaCl2溶液；克隆克隆试剂盒(宝生物工程有限公司：pMD19-T Vector*1(50 ng/ » Lcontor insert(50 ng/ LSolution I、X-Gal、IPTG、Amp。
1.1.4 主要化学药品和试剂本实验中用到的主要化学药品和试剂如表1-1所列。
表1-1主要化学药品和试剂名称纯度来源蛋白胨分析纯杭州微生物试剂有限公司牛肉膏分析纯杭州微生物试剂厂硫酸铵分析纯上海化学试剂有限公司氯化钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠分析纯金山区兴塔美兴化工厂3，5-二硝基水杨酸分析纯上海晶天生物科技有限公司苯酚分析纯杭州双林化工试剂厂氢氧化钠分析纯上海虹光化工厂盐酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司PEG 1000分析纯杭州高晶精细化工有限公司PEG 6000分析纯杭州高晶精细化工有限公司可溶性淀粉分析纯广东. 汕头市西陇化工厂无水乙醇分析纯杭州长征化工厂氯化钙分析纯上海化学试剂有限公司Tris 碱分析纯杭州南天生化试剂经营部冰乙酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司异戊醇分析纯杭州高晶精细化工有限公司溴化乙锭分析纯杭州高晶精细化工有限公司醋酸钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司EDTA分析纯广东山头市西陇化工厂SDS分析纯广东山头市西陇化工厂结晶紫实验室自配碘液实验室自配番红实验室自配琼脂粉细菌级杭州微生物试剂有限公司1.1.5主要仪器设备本实验中用到的主要仪器和设备如表1-2所列。
表1-2主要仪器和设备名称型号制造商或产地电子天平（BS323S）北京赛多利斯仪器系统有限公司酸度计（DeLta320）瑞士梅特勒-托利多加热恒温鼓风干燥箱（DGG-9070B型）上海嘉信实验仪器有限公司超净工作台（SW-CJ-2G）苏州净化设备厂电子显微镜（Nikon YS100）尼康映像仪器销售（中国有限公司高压灭菌锅（YXQ-280 SD型）嘉兴市中新医疗仪器有限公司生化培养箱（SPX-250B-Z型）上海博逊实业有限公司医疗设备厂台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1）太仓市实验设备厂PCR自动系列化分析仪（Biometra德国Biometra海尔冷藏柜（SC-209青岛海尔电器集团公司1.2实验方法1.2.1淀粉酶产生菌分离方法：涂布接种法［12］。
1.2.2淀粉酶产生菌纯化方法：平板划线法。
1.2.3淀粉酶产生菌初步鉴定方法：革兰氏染色。
1.2.4淀粉酶产生菌产酶条件优化：单因素法［11,13-14］。
根据几种变量来优化产酶条件：改变基础发酵培养基中氮源，碳源或是NaCI 等的浓度。
1、不同碳源对酶活的影响以蛋白胨为氮源，改变基础发酵培养基中碳源的种类，配制液体发酵培养基。
121 T灭菌20 min•以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5%的接种量接种12 h种子，37C, 160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。
2、不同氮源对酶活的影响以麸皮作为碳源，改变基础发酵培养基中氮源的种类，配制液体发酵培养基。
3、不同NaCI含量对酶活的影响改变基础发酵培养基中NaCI的浓度，配制液体发酵培养基。
4、初始发酵温度对酶活的影响基础发酵培养基，121C灭菌10 min。
考虑到菌株的生长温度范围是28C〜50T，故以28C, 37C, 45C，作为培养温度，以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基, 按0.5%的接种量接种12 h种子，37C, 160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。
5、培养基初始pH对最终酶活的影响基础发酵培养基，121C灭菌10 min。
考虑到菌株的生长pH范围是4.7〜9，故在pH 4〜10范围内测定酶活。
&碳氮比对产酶的影响以麸皮作为碳源，黄豆粉作为氮源配制液体发酵培养基。
1.2.5粗酶提取物的制备：双水相萃取法［15］。
双水相萃取系统系在室温（22 ± C下按重量配制。
在50 mL烧杯中加入所需重量的硫酸铵和氯化钠，PEG 1000和PEG 6000以50%浓溶液形式加入，预处理发酵液均按系统总重量的50%加入。
用1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH调节pH，体系总重量为10g，不足部分以自来水朴充。
各组分的浓度均用重量百分含量表示。
用玻璃棒搅匀烧杯中混合物，定量转至10 mL刻度离心管中，然后于2000 r/mi n离心2 min分层。
此时a-淀粉酶和蛋白酶分配到上、下两相，发酵液中不溶物和菌体以固体物形式集中在两相之间。
读出上、下两相体积，用注射器分别吸出一定量的上、下两相溶液，测定酶活和总蛋白含量。
1.2.6酶活力测定：等量对照法［16-17］。
酶活性的测定取洁净的试管若干，作好标记，每一种提取物设1个对照。
总反应体积为0.5mL ,测定管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的0.1 mol/L-1柠檬酸溶液（pH 5.6,不含底物淀粉。
将试管放入恒温40C 的水浴锅中，保温30 min后取出，立即加入1.5 mL的DNS 试剂终止反应。
再将试管置于沸水浴中10 min，取出后冰浴冷却。
取反应液稀释10倍，测定波长520 nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。
