α-淀粉酶的分离提纯

α-淀粉酶抑制剂的提取、分离及性质研究的开题报
告
一、研究背景
α-淀粉酶是参与淀粉酶解的重要酶类之一，对其抑制剂的研究具有
十分重要的意义。

α-淀粉酶抑制剂可以调节血糖水平，减少糖尿病和肥
胖等疾病的发生。

因此，开展α-淀粉酶抑制剂的研究具有重要的应用前景。

二、研究目的
本研究的目的在于提取、分离α-淀粉酶抑制剂，并对其进行性质研究。

通过分析其分子量、化学结构和酶抑制活性，为进一步开发α-淀粉
酶抑制剂提供参考。

三、研究内容
1.提取、分离α-淀粉酶抑制剂：采用溶剂提取法和柱层析法分离纯
化α-淀粉酶抑制剂。

2.分子量分析：采用SDS-PAGE电泳法检测α-淀粉酶抑制剂的分子量。

3.化学结构鉴定：采用核磁共振（NMR）和质谱（MS）等技术对α-
淀粉酶抑制剂的化学结构进行鉴定。

4.酶抑制活性测定：采用体外酶活性测定技术，对α-淀粉酶抑制剂
的酶抑制活力进行测定。

四、预期结果
本研究预计可提取到α-淀粉酶抑制剂，并通过分子量分析、化学结
构鉴定和酶抑制活性测定分别对其进行定性、定量和定性分析。

预计能
够得到α-淀粉酶抑制剂的分子量、化学结构及其酶抑制活性等重要信息。

五、研究意义
通过本研究的开展，不仅有助于改善糖尿病和肥胖等疾病的治疗，还能够为进一步研发α-淀粉酶抑制剂提供参考，具有重要的理论和应用价值。

α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。

20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。

到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。

但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。

20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。

自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。

20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。

而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。

同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。

气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。

20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。

全日制专业学位硕士研究生课程考试试卷（课程名称：植物生物技术概论）学位课 选修课□研究生年级：2013级姓名、学号：侯夏乐 2013050125学院（系、部）：农学院专业学科：作物学任课教师：韩德俊考试日期：2013年 12 月考试成绩：教师签字：白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取纯化研究计划研究背景α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，简称a-AI)是一种天然生物活性物质，属于糖苷水解酶的一种，国外称之为“starchblocker”。

a-AI能抑制肠胃道内唾液、胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到降低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高，从而有利于糖尿病患者的饮食治疗。

对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体重。

因此，可以用a-AI来防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。

天然存在的a-AI主要有3种类型，分别为[1](1)微生物产带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物；(2)微生物产多肽，如paim(来自微生物的猪胰a-AI淀粉酶抑制剂)和Haim(微生物起源人a-淀粉酶抑制剂)；(3)在豆类、谷类及其他较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。

Bowman(1945年)首次报道从芸豆中获得a-A1[2]。

白芸豆中提取的a，AI是一种具有N端糖基化的糖蛋白[2]。

作为一种热稳定的糖蛋白，a-AI 是在内质网上合成，储存在液泡内，要经过蛋白水解酶水解去抑制作用才能成为有活性的a-AI。

芸豆中发现的a-A1[3]已有3种，分别是aAI-1、aAI-2和aAI-3。

其中从芸豆中分离纠的aAI-1，是由两个糖肽亚基α(7．8 kD)和β(14 kD)组成。

它能抑制猪胰腺淀粉酶(PPA)、人胰腺淀粉酶、人唾液腺淀粉酶和一些鞘翅昆虫四纹豆象、绿移象、粉虫的α-淀粉酶。

张琪等的实验研究表明[4]a-AI能降低小肠各部分尤其是小肠前端的二糖酶活性。

a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37C,24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

α-淀粉酶的提‎取、分离及测定‎（生化试验小‎组-2005.4）试验全程安‎排：试验一、色谱分离淀‎粉酶1.1 试剂及设备‎离子交换树‎脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试‎管）1.5ml离心‎管紫外分光光‎度计α-淀粉酶样品‎秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液‎（pH8.0，0.01M磷酸‎盐缓冲液）洗脱缓冲液‎（平衡缓冲液‎+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化‎钠）试剂瓶1.2 离子交换色‎谱原理与方‎法色谱(chrom‎a togr‎a phy)是一种分离‎的技术,随着现代化‎学技术的发‎展应运而生‎。

20世纪初‎在俄国的波‎兰植物化学‎家茨维特(Twsee‎t)首先将植物‎提取物放入‎装有碳酸钙‎的玻璃管中‎，植物提取液‎由于在碳酸‎钙中的流速‎不同分布不‎同因此在玻‎璃管中呈现‎出不同的颜‎色，这样就可以‎对各种不同‎的植物提取‎液进行有效‎的成分分离‎。

到1907‎年茨维特的‎论文用俄文‎公开发表，他把这种方‎法命名为c‎hroma‎t ogra‎p hy, 即中文的色‎谱，这就是现代‎色谱这一名‎词的来源。

但由于茨维‎特当时没有‎知名度，而且能看懂‎俄文的人也‎不多，加之很快爆‎发了第一次‎世界大战，茨维特的分‎离方法一直‎被束之高阁‎。

20世纪2‎0年代，许多植物化‎学家开始采‎用色谱方法‎对植物提取‎物进行分离‎，色谱方法才‎被广泛地应‎用。

自20世纪‎40年代以‎来以Mar‎t in 为首‎的化学家建‎立了一整套‎色谱的基础‎理论使色谱‎分析方法从‎传统的经验‎方法总结归‎纳为一种理‎论方法，马丁等人还‎建立了气相‎色谱仪器使‎色谱技术从‎分离方法转‎化为分析方‎法。

20世纪5‎0年代以后‎由于战后重‎建和经济发‎展的需要，化学工业特‎别是石油化‎工得到广泛‎的发展，亟需建立快‎速方便有效‎的石化成分‎分析。

而石化成分‎十分复杂，结构十分相‎似，且多数成分‎熔点又比较‎低，气相色谱正‎好吻合石化‎成分分析的‎要求，效果十分明‎显、有效。

自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。

淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。

根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。

α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。

如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。

随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。

生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。

70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。

研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。

除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。

Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。

真菌α-淀粉酶的研究和应用16120901 20092348 王德美摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

α-淀粉酶在现代淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制及生料酒精等行业已得到广泛的应用。

随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有重要地位。

对真菌α-淀粉酶的研究和利用，为满足国内市场需求、调整我国酶制剂工业结构和带动相关食品或发酵行业的发展等具有重要意义。

关键词：真菌α-淀粉酶，可发酵性糖，固态发酵，冷冻沉析，食品应用1.真菌α-淀粉酶的结构及其催化机制1.1真菌α-淀粉酶的结构与大多数α-淀粉酶类似，真菌α-淀粉酶通常含有三个结构域，分别称为A、B和C。

结构域A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为（a/b）8TIM-桶状结构，结构域B和结构域C基本上位于结构域A得到对立两端【1】。

其中，Ca2+的保守结合位点位于结构域A和结构域B之间的表面区域，而大多数情况下Ca2+的存在对于α-淀粉酶家族保持其酶活力和稳定性是必须的。

结构域B位于TIM-桶状结构域的第三个β-折叠和第三个α-螺旋之间，该区域富含不规则的β-片层结构，在不同的淀粉酶中的大小和结构差异较大，被认为与α-淀粉酶的第五特异性有关。

同时，通过定点突变或随机突变结果表明，该部位在淀粉酶中核能相对比较脆弱，与α-淀粉酶的总体稳定性关联密切，其中部分氨基酸的改变对酶的pH稳定性和热稳定性影响较为显著。

结构域C形成α-淀粉酶蛋白质羧基端，并含有α-淀粉酶家族所特有的希腊钥匙β-sandwich结构，通常认为其通过将结构域A的疏水区域与溶剂相隔离以稳定催化区域或TIM桶状结构【2】。

1.2真菌α-淀粉酶的催化机制通过X-射线晶体结构、化学修饰和定点突变等手段，表明Asp206、Glu230和Asp2973个氨基酸可能是α-淀粉酶、家族的核心催化位点【3】。

α-淀粉酶分离提纯技术研究进展摘要：为了更好地研究α-淀粉酶的性质与应用α-淀粉酶，我们需要不断地从不同的生物体内提取α-淀粉酶并将其高纯化。

随着生物技术的不断发展，分离提纯的方法也越来越复杂越精确，然而它却为生物学的发展奠定了一定的基础，此篇综述简要地说明近年来国内外在α-淀粉酶的分离纯化等方面成就，也部分介绍了α-淀粉酶的研究现状和工业应用以及发展前景。

关键字：α-淀粉酶分离提纯现状应用前景α-淀粉酶(α-Amylase)是一种内切葡萄糖苷酶，属于淀粉酶。

米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1,4,葡萄糖苷键，在催化水解α-1,4-糖苷键只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60-90℃，最适宜作用温度为60-70℃，作用pH值范围5.5-7.0，最适pH值为6.0。

Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。

主要存在于人的唾液和胰脏中也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。

一、α-淀粉酶分离提纯的研究历史与现状1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉(Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲 600单位。

用硫酸铵分段沉淀，Sephadex G一75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化，经PAGE 鉴定为一条带。

以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖分别占6.4％、32.3％、37.1％、10.9％。

麦芽糖和麦芽三糖二者之和占69.4％,与Novo公司Norman报道的相似，属糖化型α-淀粉酶，可用于制糖、啤酒和面包食品工业，并可以替代一淀粉酶生产麦芽糖浆。