实验四 腹水型单抗的制备及纯化

单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。

常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1）饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。

临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐常用柱层析或透析法。

柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。

第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。

透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。

单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
1，腹水少或者无腹水产生
①致敏不正确，不正确的使用致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久，一般是7-14天，具体看小鼠的腹部情况。

②杂交瘤细胞或者致敏剂的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，太多或者细胞状态不好。

一般不50万个细胞左右为宜。

④建议使用母鼠或者生育过的母鼠制备腹水。

2，腹水没有效价
①制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。

②致敏小鼠时采用了错误的致敏剂。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，或者细胞状态不好。

④由于注射方式和部位错误，形成了实体瘤。

杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。

以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。

2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。

3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。

将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。

4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。

洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。

5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。

6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。

需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。

在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

动物的选择与免疫1. 动物的选择：纯种BALB/C小鼠2. 免疫方案：根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。

初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。

③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

细胞融合（1）主要试剂的配制a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。

b、氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）: 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。

过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

单抗纯化主要工艺步骤单抗纯化，这可真是个有趣又充满挑战的事儿啊！首先呢，细胞培养这一步就像是给单抗准备一个舒适的家。

得让细胞们在合适的环境里好好生长，大量繁殖，这样才能产生足够多的单抗呀。

就好像农民伯伯精心照料庄稼，期待着丰收一样。

然后就是收集啦，这就像是把成熟的果实摘下来。

把含有单抗的培养液收集起来，可不能有一点马虎，要把好东西都留下来。

接下来，过滤可就重要啦！这就好比是把杂质筛出去，只留下我们想要的单抗精华。

把那些大大小小的杂质都挡在外面，让单抗能够纯净地展现在我们面前。

再说说层析吧，这可真是个神奇的步骤。

就像是一个超级分拣员，能把不同的物质分开。

单抗在这里就会乖乖地找到自己的位置，和其他杂质说拜拜啦。

还有超滤浓缩呀，这就像把精华进一步提炼，让单抗变得更加纯粹和浓郁。

把多余的水分去掉，让单抗更加集中。

你想想看呀，如果这些步骤没做好，那得到的单抗能纯吗？能好用吗？那肯定不行呀！所以每个步骤都得认认真真，不能有一点马虎。

在单抗纯化的过程中，每一个工艺步骤都像是一场战斗，我们要和杂质战斗，要和不确定性战斗。

但只要我们用心去做，就一定能取得胜利，得到我们想要的纯净单抗。

这就好像是一场精彩的表演，每个步骤都是一个精彩的节目。

细胞培养是开场舞，热闹而充满活力；收集是精彩的独唱，把重点展现出来；过滤是优美的舞蹈，把不好的都剔除；层析是神奇的魔术，让单抗各归其位；超滤浓缩是最后的高潮，把精华展现得淋漓尽致。

单抗纯化的主要工艺步骤，可不只是一些简单的操作，它们是一门艺术，一门需要我们用心去钻研、去实践的艺术。

只有这样，我们才能在单抗纯化的道路上越走越远，为医学事业、为人类的健康做出更大的贡献。

你说是不是呢？反正我是这么认为的呀！。

小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。

下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。

免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。

2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。

使用无菌器具，注意操作过程要无菌。

3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。

然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。

4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。

浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。

浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。

5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。

亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。

6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。

可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。

洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。

7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。

这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。

8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。

在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。

以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。

根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。

另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。