腹水抗体制备一般流程

单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
1，腹水少或者无腹水产生
①致敏不正确，不正确的使用致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久，一般是7-14天，具体看小鼠的腹部情况。

②杂交瘤细胞或者致敏剂的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，太多或者细胞状态不好。

一般不50万个细胞左右为宜。

④建议使用母鼠或者生育过的母鼠制备腹水。

2，腹水没有效价
①制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。

②致敏小鼠时采用了错误的致敏剂。

③接种的杂交瘤细胞数量太少，或者细胞状态不好。

④由于注射方式和部位错误，形成了实体瘤。

杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。

以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。

2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。

3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。

将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。

4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。

洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。

5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。

6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。

需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。

在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。

这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。

2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。

3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。

4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。

我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。

有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。

还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。

我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。

制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

专利名称：一种制备单克隆腹水抗体的方法专利类型：发明专利
发明人：李川江
申请号：CN201610327059.0
申请日：20160517
公开号：CN105925539A
公开日：
20160907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种制备单克隆腹水抗体的方法，该方法为将远交系小鼠腹腔注射降脂烷后，接种骨髓瘤杂交瘤细胞，3~7天开始每天采集腹水；采集的腹水立即用离心机离心，放置4℃，次日取出再离心和用虑紙过滤，即可用硫酸氨沉淀、柱层析纯化，获得抗体。

本发明采用远交系小白鼠代替BALB/c小白鼠，用于制备单克隆腹水抗体，该品系小白鼠的优点是繁殖能力强，对饲养条件要求低，价格很便宜，仅为BALB/c小鼠的1/5左右；而且体型较大，对实验耐受性好，因此腹水产量大，是BALB/c小鼠的数倍，抗体效价不低于BALB/c小鼠，而且抗体对温度的稳定性远高于BALB/c 小鼠。

申请人：广东华银医药科技有限公司
地址：510663 广东省广州市经济技术开发区广州科学城揽月路80号广州科技创新大厦创新基地C 区第三层
国籍：CN
代理机构：广州嘉权专利商标事务所有限公司
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小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。

下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。

免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。

2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。

使用无菌器具，注意操作过程要无菌。

3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。

然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。

4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。

浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。

浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。

5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。

亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。

6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。

可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。

洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。

7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。

这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。

8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。

在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。

以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。

根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。

另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。

小白鼠腹水瘤药理学实验报告1．抗原的处理与小鼠腹水粗抗体的收集现在以B亚基的抗体制备为例说明：取2mg的蛋白，溶于100µl的10％SDS中，加入等体积的上样缓冲液，沸水浴3min，进行SDS－PAGE。

将胶的两边缘切带染色，脱色后在相应的位置从分离胶上切下未染色目的蛋白带，无菌水洗涤，用匀浆器匀浆后，再在2～5mM的PBS 中透析5h以上，冷干。

将冷干的样品用500～800µl的2mM～5mM的PBS溶解（得到体积约600～1000µl）,加入等体积的弗氏完全佐剂，大约乳化2h～3h。

确保乳化完的蛋白浓度为0.5~1.0mg/ml。

将乳化好的混合液用1ml 的一次性注射器注射小鼠，每只50～100µl，即50～100µg的抗原蛋白。

第一次加强注射：10～14天后将制备的样品用弗氏不完全佐剂乳化，同样注射小鼠。

第一次加强注射后10天左右，用小鼠的血清，通过酶联免疫的方法（ELISA）测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。

第二次加强注射：如果ELISA得到阳性的结果，用弗氏不完全佐剂乳化抗原，再次注射小鼠，并在注射后的2～3天后注射H22腹水瘤细胞，每次注射量再1.5×106~2.0×106个细胞，7天后产生腹水。

如果两周后小鼠仍无腹水，再次注射抗原以及瘤细胞。

收集腹水，每只小鼠可以收集几次，每次3～10ml不等，收集腹水至小鼠死亡。

腹水中加入0.01%的叠氮化钠以防止长菌，再在12000rpm离心2次，保留上清。

测定效价后，进行抗体的纯化，分装，－70°C保存。

[注]：（1）在SDS-PAGE时，分离胶中加入300µlSDS，浓缩胶中加入200µlSDS，以确保SDS足量。

（2）在制备蛋白样品过程中会损失一部分抗原大约25％～50％（3）收集的小鼠腹水要分装到小指管中，不同的小鼠产生的腹水效价不同，做好标记。