腹水抗体制备一般流程

杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。

以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。

2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。

3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。

将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。

4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。

洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。

5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。

6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。

需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。

在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。

实验四腹水型单抗的制备及纯化迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。

本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。

可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。

而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。

材料：1、成年BALB/c小鼠。

2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水（或冻存的腹水）。

3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。

方法：一、腹水的制备1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，0.2-0.3ml/只。

2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。

3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。

将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。

二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。

辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。

【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。

○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。

2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。

3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。

抗体制备流程抗体制备是生物学研究中常见的实验技术之一，也是一项复杂而精细的工作。

下面将介绍抗体制备的一般流程，以供参考。

1. 抗原制备。

首先，需要准备抗原。

抗原可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。

通常情况下，我们会通过基因工程技术来表达和纯化抗原蛋白。

在这一步骤中，需要注意保持抗原的天然构象和活性。

2. 免疫动物的选择。

选择合适的免疫动物也是非常重要的。

常见的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。

在选择免疫动物时，需要考虑到免疫动物的体积、生理特征、抗原的种类等因素。

3. 免疫程序。

将制备好的抗原充分混合并与免疫动物进行免疫。

免疫的途径可以是皮下注射、腹腔注射等。

在免疫过程中，需要根据实验要求进行多次免疫，以提高抗体的效价。

4. 血清收集。

在完成免疫程序后，需要定期采集免疫动物的血清样本。

血清中含有免疫动物产生的抗体，可以用于后续的实验。

5. 抗体纯化。

从采集到的血清样本中，可以通过蛋白A/G亲和层析柱或其他纯化手段来纯化抗体。

纯化后的抗体可以用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）等实验。

6. 抗体鉴定。

鉴定纯化后的抗体的效价和特异性也是必不可少的步骤。

常用的鉴定方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等。

7. 抗体保存。

最后，需要将鉴定合格的抗体进行分装并保存。

在保存过程中，需要注意避免抗体的冻融循环，以保证抗体的稳定性和活性。

总结。

抗体制备是一项复杂的实验技术，需要研究人员具备扎实的实验技能和丰富的经验。

在实验过程中，需要严格控制各个步骤的条件和参数，以保证抗体的质量和稳定性。

希望本文介绍的抗体制备流程能对您有所帮助。

小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。

下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。

免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。

2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。

使用无菌器具，注意操作过程要无菌。

3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。

然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。

4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。

浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。

浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。

5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。

亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。

6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。

可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。

洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。

7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。

这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。

8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。

在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。

以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。

根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。

另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。

抗体制备抗体制备是生物技术领域中的一个重要过程，它涉及多个步骤，目的是为了获取特定的抗体，这些抗体可以用于诊断、治疗以及科学研究。

以下是抗体制备的一般流程：1. 抗原的选择与制备抗原选择：根据需要制备的抗体类型，选择相应的抗原。

抗原通常是一种能引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽、多糖等。

抗原制备：如果抗原是蛋白质，可能需要通过重组DNA技术在细胞中表达并纯化。

如果抗原较小，可能需要通过化学方法合成。

2. 动物免疫宿主选择：通常选用小鼠、大鼠、兔子或者羊等动物作为宿主。

免疫程序：将抗原与佐剂混合后，通过注射的方式引入动物体内，以刺激免疫系统产生抗体。

通常需要多次免疫才能获得足够数量的抗体。

3. 采集和检测采集血液：免疫数周后，从动物体内采集血液。

分离血清：血液离心后，取上层的血清，其中含有抗体。

检测抗体：通过ELISA、Western blotting、免疫荧光等方法检测抗体的特异性和亲和力。

4. 抗体纯化沉淀法：如铵硫酸盐沉淀法。

色谱法：包括离子交换色谱、亲和色谱（利用蛋白A或蛋白G 亲和抗体Fc区）等。

5. 抗体标记（如需）酶标记：如与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶结合。

荧光标记：如FITC或PE标记。

同位素标记：用于放射免疫检测。

6. 单克隆抗体制备（如果需要）融合：将已免疫动物的脾细胞与恒温动物骨髓瘤细胞融合。

筛选：利用HAT培养基筛选出能够产生所需抗体的杂交瘤细胞。

克隆：将杂交瘤细胞进行单细胞克隆，确保抗体的一致性。

培养和扩大：将筛选出的杂交瘤细胞在体外培养或者在特定的动物体内扩大。

抗体采集和纯化：从培养基或动物的腹水中采集含有单克隆抗体的液体，并进行纯化。

7. 质量控制抗体活性：检测抗体的亲和力和特异性。

抗体纯度：通过SDSPAGE、HPLC等方法检测纯度。

抗体稳定性：进行长时间存储后，检测抗体的稳定性。

8.包装和保存包装：按照需求包装成不同规格。

保存：通常在低温条件下保存，例如20℃或者80℃，有时添加甘油或蛋白稳定剂。