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利用SRAP、SSR和AFLP标记构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱李媛媛;沈金雄;王同华;傅廷栋;马朝芝【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2007(040)006【摘要】[目的]建立甘蓝型油菜的高质量遗传图谱,为在分子水平上研究复杂性状打下基础并提供保证.[方法]以甘蓝型油菜自交不亲和系"SI-1300" 及其恢复系"Eagle"组配得到的184个F2单株为群体,利用SRAP、SSR和AFLP标记技术构建甘蓝型油菜遗传图谱.[结果]该图谱共包含21个连锁群,涉及137个SRAP标记、143个SSR标记和118个AFLP标记.图谱总长1 949.8 cM,标记间平均图距为4.9 cM.以SSR标记为锚定标记,该图谱与国际标准图谱进行了初步对应.研究共发现了8个偏分离区域.[结论]根据对标记分布的均匀程度,图谱覆盖程度以及标记密度等方面的分析,本研究构建的甘蓝型油菜分子遗传图谱质量较高,并且SRAP标记可能是比AFLP标记更适合于图谱构建的标记体系.【总页数】9页(P1118-1126)【作者】李媛媛;沈金雄;王同华;傅廷栋;马朝芝【作者单位】华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.利用SRAP和SSR标记构建红麻遗传连锁图谱 [J], 武耀龙;李德芳;李建军;黄思齐;李辉;唐慧娟;陈安国2.应用SSR和SRAP标记构建青虾遗传连锁图谱 [J], 乔慧;吴滟;傅洪拓;龚永生;蒋速飞;熊贻伟3.基于SRAP和SSR标记构建的杏扁遗传连锁图谱 [J], 王晓燚;孔德晶;艾鹏飞4.高丹草SRAP和SSR分子遗传连锁图谱的构建 [J], 石悦;于肖夏;南志标;于卓;吴国芳;杨东升;张明飞5.四倍体杂交冰草SRAP和SSR分子标记遗传连锁图谱构建 [J], 杨东升;于卓;于肖夏;李晓宇;吴国芳;石悦;张明飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体的构建摘要：将甘蓝型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp 反义片段构建到中间载体pCambia2301G中，替换GUS基因，由CaMV35S启动子驱动，形成了反义植物表达载体，命名为pCambia2301G-MYB4A，并转化到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，为进一步研究甘蓝型油菜MYB4基因家族的功能奠定基础。
关键词：甘蓝型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代谢途径；MYB4基因甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。
甘蓝型油菜中与苯丙烷代谢途径相关的农艺性状是研究人员长期致力于遗传改良的焦点。
经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化[1-3]。
另外，油菜种皮栅状细胞层中的色素主要与种皮中类黄酮类物质紧密相关，种皮中类黄酮类物质积累越多，种皮的颜色就越深，积累越少或没有时种皮就呈黄色，即呈现种胚的颜色，从而表现出黄子性状的优质特性[4，5]。
AtMYB4属于拟南芥R2R3-MYB家族的一种新的负调控转录因子，对于植株中抗紫外线类的芥子酸酯类物质的合成具有重要调控作用，该基因在大多数的植物组织中均有表达。
研究发现拟南芥AtMYB4基因突变体叶片中芥子酸酯的含量升高，并呈现出比野生型更强的紫外线耐受能力。
已报道AtMYB4转录因子调控苯丙烷代谢途径关键酶基因C4H的表达[6-8]。
因此，研究MYB4基因有利于阐明甘蓝型油菜苯丙烷类物质合成和相关性状形成的分子机理。
本研究通过构建甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体，为研究MYB4基因家族功能，阐明油菜木质素、种皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成机制奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种及质粒 E. coli DH5α、根癌农杆菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表达中间载体pCambia2301G均由重庆市油菜工程技术研究中心保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。
青杂5号甘蓝型油菜的高效再生及农杆菌侵染转化体系的建立谢雅晶;武爱华;刘贤金【摘要】以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种青杂5号的子叶、下胚轴外植体为受体,分别对芽分化培养基、芽生长培养基、生根培养基进行激素组合优化研究,建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生系统.结果表明,青杂5号下胚轴分化率最高为子叶的3倍,可达90％左右;优化的分化培养基为MSB+5 mg/L噻二唑苯基脲(thidiazuron,TDZ)+7.5 mg/L AgNO3+ 0.1 mg/L NAA+2 mg/L脯氨酸(proline,L-Pro) +250 mg/L酸水解酪蛋白(casein acid hydrolysate,CH)+3％蔗糖;生长培养基为1/2 MSB+1 mg/L IBA+2 mg/LL-Pro+ 250 mg/L CH+1.5％蔗糖;生根培养基为1/2 MSB +0.2 mg/L IAA+ 1.5％蔗糖.在此基础上,构建模拟Bt 的抗虫基因B12的双元表达载体,采用农杆菌介导的方法转化油菜下胚轴,并利用潮霉素及羧苄青霉素对再生植株进行筛选;通过对转基因植株叶片基因组DNA的PCR检测及叶片GUS组织化学染色的分析,发现抗虫基因已整合到油菜植株的细胞核基因组中,并能正常表达;通过小菜蛾接种试验对该抗虫基因进行杀虫效果评价.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(043)012【总页数】6页(P17-22)【关键词】甘蓝型油菜;下胚轴高效再生;农杆菌介导转化;抗虫基因;GUS染色;转基因植株【作者】谢雅晶;武爱华;刘贤金【作者单位】江苏省食品质量安全重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;江苏省食品质量安全重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;南京农业大学植物保护学院,江苏南京210095;江苏省食品质量安全重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S634.304+.3甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是籽粒产量最高的油用油菜品种，目前在我国长江中下游流域大量种植，是我国重要的油料作物。
油菜高效再生体系的建立及草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化油菜（Brassica napus L.）是我国重要的油料作物之一，具有经济价值和广泛的应用前景。
然而，长期以来，油菜产量受到各种生物和环境因素的限制，仍然存在许多种植难题需要解决。
为了提高油菜的产量和抗逆性，高效再生体系的建立和草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化研究变得尤为重要。
高效再生体系的建立是进行油菜遗传改良研究的基础。
通过构建适宜的培养基和处理条件，可以实现油菜种子胚离体、茎段、花药及其它适宜植物材料的大规模快速再生。
例如，通过选用含有适宜激素和维生素的MS培养基，以及优化处理条件，可以实现油菜胚离体的快速再生。
同时，还可以通过细胞间质体转化、基因枪等技术手段，将外源基因导入油菜细胞，实现外源基因在油菜中的表达和功能验证。
草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化是改良油菜的重要手段之一。
草甘膦是一种广谱除草剂，对多种杂草有良好的杀灭效果。
然而，草甘膦对油菜等蓝莓科作物有毒性，因此，通过遗传转化油菜，导入草甘膦抗性基因EPSPs，可以使油菜对草甘膦具有耐受性，从而改善油菜种植的生态环境。
同时，BnGRF2基因是油菜生长发育过程中的关键基因，其过表达可以显著提高油菜的产量。
在遗传转化油菜过程中，可以通过构建适宜的表达载体，并利用农杆菌介导的遗传转化技术将载体导入油菜细胞。
通过筛选和鉴定转基因油菜，在基因层面上验证和表达外源基因，在组织培养和分子生物学实验中进行功能验证，最终获得稳定和高效的杂交油菜新品种。
总之，油菜高效再生体系的建立和草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化研究对于提高油菜产量和抗逆性具有重要意义。
通过构建适宜的培养基和处理条件，实现油菜材料的快速再生；通过遗传转化油菜，导入草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2基因，可以提高油菜的耐受性和产量。
这将对我国油菜种植业的发展和粮食安全具有重要意义。
专利名称：一种甘蓝型油菜异性叶片新型恢复系创制的方法专利类型：发明专利
发明人：伍林涛,奉斌,杜才富,韩宏仕,秦信蓉,曾章丽
申请号：CN201410422050.9
申请日：20140826
公开号：CN104429919A
公开日：
20150325
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种甘蓝型油菜异性叶片新型恢复系创制的方法，它通过选择优良的甘蓝型油菜恢复系品系进行小孢子培养，在培养期用0.02-0.2%浓度的秋水仙素进行诱导加倍处理，获得异形叶片突变株，利用该突变株自交2代，在无突变性状分离群体选择单株，然后以原优良的甘蓝型油菜恢复系品系为轮回亲本进行回交、自交，在后代分离群体选育异形叶片新型恢复系品系，可与不育系配制新的强优势杂交组合油菜品种。
本发明可有效提高制种纯度、制种产量，降低了制种成本与制种风险，同时无需进行隔离。
由于在最初对突变株进行遗传改良的时候使用的是优良恢复系，未导入不育系血缘，有利于不育系育恢复系的种群划分，易筛选配制强优势杂交组合。
申请人：贵州省油菜研究所,伍林涛
地址：550081 贵州省贵阳市白云大道027--0061号
国籍：CN
代理机构：贵阳中新专利商标事务所
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共培养基对甘蓝型油菜下胚轴GUS瞬间表达及转化效率的影响许本波;殷家明;谢伶俐;李加纳;柴友荣【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2007(035)025【摘要】为提高根癌农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化效率,以甘蓝型油菜"湘油15"下胚轴为外植体,以MS为基本培养基,研究了共培养基中α-NAA和6-BA浓度对根癌农杆菌介导法转化甘蓝型油菜过程中下胚轴GUS基因瞬间表达及转化效率的影响.结果表明,共培养基对GUS基因的瞬间表达和稳定表达具有重要影响,但共GUS基因的瞬间表达率和转化效率之间没有明显的线性关系.【总页数】3页(P8062-8064)【作者】许本波;殷家明;谢伶俐;李加纳;柴友荣【作者单位】重庆市油菜工程技术研究中心,西南大学农学与生物科技学院,重庆,400716;长江大学生命科学学院,湖北荆州,434025;重庆市油菜工程技术研究中心,西南大学农学与生物科技学院,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,西南大学农学与生物科技学院,重庆,400716;长江大学生命科学学院,湖北荆州,434025;重庆市油菜工程技术研究中心,西南大学农学与生物科技学院,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,西南大学农学与生物科技学院,重庆,400716【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.超声波辅助对农杆菌介导新红星苹果遗传转化中gus基因瞬间表达的影响 [J], 刘莉莉;刘丹;丛郁;章镇2.农杆菌介导的几个甘蓝型油菜下胚轴转化体系研究 [J], 江洪;李平;王世全;李双成;邹良平;起登凤3.乙酰丁香酮对棉花下胚轴遗传转化效率的影响 [J], 郑树松;安成才;李启任;陈章良4.根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶GUS基因瞬间表达 [J], 谢伶俐;李加纳;殷家明;柴友荣;许本波;林呐5.农杆菌培养方式和预培养基激素配比对甘蓝型油菜下胚轴转化效应分析 [J], 孙洁;黄团;李加纳;殷家明;柴友荣;丁彩霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
收稿日期:２０１８－１０－２３㊀㊀修回日期:２０１８－１２－１３基金项目:国家自然科学基金面上项目(３１４７１７３９)ꎻ大学生创新创业计划训练项目(２０１８１０３８９０３２).作者简介:许静(１９８８－)ꎬ女ꎬ博士研究生.研究方向:植物抗病机制.Ｅｍａｉｌ:ｓｍｉｌｅｘｕｊ＠１６３.ｃｏｍ.通信作者王爱荣(１９７５－)ꎬ女ꎬ副教授ꎬ博士.研究方向:分子植物病理学㊁植物真菌病害.Ｅｍａｉｌ:ａｒｘｇ３０００＠１６３.ｃｏｍ.甘蓝型油菜ＳＮＡＲＥ蛋白ＳＹＰ１２２叶片瞬时表达体系的建立许㊀静ꎬ单亚楠ꎬ何㊀豆ꎬ陈淞渝ꎬ庄㊀炜ꎬ王爱荣(福建农林大学植物保护学院ꎬ福建福州３５０００２)摘要:通过生物信息学鉴定了油菜中的突触融合蛋白ＢｎＳＹＰ１２２ꎬ其由一个Ｎ端ｓｙｎｔａｘｉｎ结构域㊁一个典型的ＳＮＡＲＥ基序及一个Ｃ端跨膜结构域组成ꎬ并且Ｎ端结构域包含被称为Ｈａ㊁Ｈｂ㊁Ｈｃ基序的３个α￣螺旋束.进一步利用Ｇａｔｅｗａｙ技术成功将目的蛋白构建于植物表达载体ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４上ꎬ与带有绿色荧光蛋白的ｐＥＧＡＤ分别转化农杆菌ＧＶ３１０１菌株ꎬ采用农杆菌介导的真空渗透法在油菜叶片中进行瞬时表达.经激光共聚焦显微镜观察和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明ꎬ农杆菌介导的真空渗透法能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白ꎬ同时验证了ＢｎＳＹＰ１２２定位在细胞膜上.关键词:油菜ꎻ瞬时表达ꎻ真空渗透法ꎻＢｎＳＹＰ１２２ꎻ绿色荧光蛋白中图分类号:Ｓ４３２.１文献标识码:Ａ文章编号:１６７１￣５４７０(２０１９)０４￣０４５９￣０７ＤＯＩ:１０.１３３２３/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊ.ｆａｆｕ(ｎａｔ.ｓｃｉ.).２０１９.０４.００９ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＳＮＡＲＥｐｒｏｔｅｉｎＳＹＰ１２２ｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｌｅａｖｅｓＸＵＪｉｎｇꎬＳＨＡＮＹａｎａｎꎬＨＥＤｏｕꎬＣＨＥＮＳｏｎｇｙｕꎬＺＨＵＡＮＧＷｅｉꎬＷＡＮＧＡｉｒｏｎｇ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＦｕｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ３５０００２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＡＳＮＡＲＥｐｒｏｔｅｉｎ(ＢｎＳＹＰ１２２)ｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆａＮ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｓｙｎｔａｘｉｎｄｏｍａｉｎｗｉｔｈ３α￣ｈｅｌｉｃａｌｂｕｎｄｌｅｓｃａｌｌｅｄＨａꎬＨｂꎬａｎｄＨｃｍｏｔｉｆｓꎬａｔｙｐｉｃａｌＳＮＡＲＥｍｏｔｉｆａｎｄａＣ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ.ＳｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙꎬＢｎＳＹＰ１２２ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４ｂｙＧａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅꎬａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＧＶ３１０１ｓｔｒａｉｎｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ.ＴｈｅｖｅｃｔｏｒｏｆｐＥＧＡＤｗｉｔｈｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｓｃｏｎｔｒｏｌｗａｓａｌｓｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＧＶ３１０１ｓｔｒａｉｎｏｆＡ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ.ＴｈｅｎｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢ.ｎａｐｕｓｌｅａｖｅｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｖａｃｕｕｍｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ.ＬａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｖａｃｕｕｍｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｃｏｕｌｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢ.ｎａｐｕｓｌｅａｖｅｓ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬＢｎＳＹＰ１２２ｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｏｂｅｌｏｃａｔｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓꎻｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｖａｃｕｕｍｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄꎻＢｎＳＹＰ１２２ꎻＧＦＰ油菜是我国继水稻㊁玉米㊁小麦㊁大豆之后的第五大作物[１]ꎬ种植面积超过７５０万ｈｍ２[２]ꎬ其不仅是重要的油料作物ꎬ还是潜在的生物能源原料[３].油菜主要有３个栽培种ꎬ即甘蓝型油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)㊁芥菜型油菜(Ｂ.ｊｕｎｃｅａ)和白菜型油菜(Ｂ.ｒａｐａ)[４]ꎬ其中以甘蓝型油菜的种植范围最广[５].随着基因工程技术的迅猛发展ꎬ转基因技术成为油菜基因功能研究的重要方法.目前常用的遗传转化方法有根癌农杆菌介导法㊁聚乙二醇(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌꎬＰＥＧ)法㊁基因枪法㊁真空渗透遗传转化法和花粉介导法等[６－７].这些方法都不可避免地要经过脱分化及再分化过程ꎬ不仅耗时长㊁影响因素众多ꎬ而且对操作者的技术能力及试验条件都有较高的要求.农杆菌介导的基因瞬时表达系统可在短时间内大量表达外源基因ꎬ不需要经过世代培养ꎬ这使其成为基因功能研究的利器[８].近年来ꎬ学者们虽然针对油菜建立了农杆菌介导的瞬时表达系统ꎬ但是仅局限于子叶[６]和原生质体[９].为了高效地开展油菜基因功能的研究ꎬ在油菜叶片中建立一个成熟的基因表达体系显得尤为重要.植物ＳＮＡＲＥ(ｓｏｌｕｂｌｅＮ￣ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆａｃｔｏｒａｔｔａｃｈｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ)蛋白是参与细胞膜融福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷第４期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ)２０１９年７月０６４ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀合的一类重要蛋白ꎬ其家族成员在多种生物学过程中发挥重要作用ꎬ包括生长动态平衡㊁激素调节㊁胁迫反应和免疫反应[１０－１２].这类蛋白中ꎬ研究最深入的是ＰＥＮ１(ＳＹＰ１２１)ꎬ它对植物抗白粉病起着关键作用[１０].拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)ＡｔＳＹＰ１２１及其同源蛋白ＡｔＳＹＰ１２２在植物的防御信号途径中起着负调控作用ꎬ是细胞程序性死亡(ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈꎬＰＣＤ)以及水杨酸(ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄꎬＳＡ)㊁茉莉酸(ｊａｓｍｏｎｉｃａｃｉｄꎬＪＡ)和乙烯(ｅｔｈｙｌｅｎｅꎬＥＴ)信号通路的负调控因子[１３].然而ꎬＡｔＳＹＰ１２２对植物抗白粉病的作用很小[１４－１５].在细胞膜分泌或锚定在细胞膜的蛋白中ꎬ二者的货物蛋白群体也存在较大差别[１６－１７].本实验室前期研究发现ꎬ油菜ＳＹＰ１２２同源蛋白在抗死体营养型病原菌 核盘菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)方面发挥重要功能.本研究拟克隆甘蓝型油菜中双九号的ＢｎＳＹＰ１２２基因ꎬ并将其构建到带有黄色荧光蛋白(ｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＹＦＰ)的植物表达载体ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４上ꎬ通过农杆菌介导的真空渗透法在４周龄油菜的叶片中表达ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２及绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)ꎬ通过荧光观察和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测分析其表达效果ꎬ初步验证油菜ＢｎＳＹＰ１２２的亚细胞定位ꎬ以期为进一步阐明ＢｎＳＹＰ１２２在油菜抗菌核病中的功能提供一定的依据ꎬ并为油菜基因功能研究提供一定的技术支持.１㊀材料与方法１.１㊀材料供试植物为甘蓝型油菜中双九号ꎬ种子播于含黑土和蛭石(１ʒ１)的营养土中ꎬ置于２３ħ的温室中ꎬ光暗比为１６ｈʒ８ｈꎬ光照度为５５００ｌｘꎬ覆盖保鲜膜培养３~４ｄ.待幼苗子叶展开ꎬ去掉保鲜膜ꎬ一周后将油菜苗移栽至新的花盆中ꎬ每３~５ｄ浇水一次ꎬ１０ｄ浇营养液一次ꎬ继续培养３~４周ꎬ至油菜长出４~５片真叶ꎬ即可用于瞬时表达.瞬时表达所用的对照载体ｐＥＧＡＤ￣ＧＦＰ㊁构建重组载体所用Ｇａｔｅｗａｙ方法克隆入门载体ｐＤＯＮＲ/Ｚｅｏ㊁植物表达载体ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４(３５Ｓ￣ＹＦＰ￣Ｇａｔｅｗａｙ￣ＯＣＳ３ᶄ)为本实验室留存.试验所用的真空泵为ＡＦ２０００真空抽滤器(购自宁波奉化晨光威腾自动化机械有限公司).１.２㊀方法１.２.１㊀ＢｎＳＹＰ１２２基因的鉴定及序列分析㊀在拟南芥数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ｏｒｇ/)中搜索ＡｔＳＹＰ１２２ꎬ得到其编码基因及蛋白的氨基酸序列ꎬ将该序列作为模板在油菜数据库(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ.ｃｎｓ.ｆｒ/ｂｒａｓｓｉ￣ｃａｎａｐｕｓ/)中ＢＬＡＳＴ之后ꎬ获得与ＡｔＳＹＰ１２２最同源的序列ꎬ根据该序列的开放阅读框(ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)设计引物.采用油菜中抗品种中双九号[１８]的ｃＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ将获得的片段构建于ｐＭＤ１８￣Ｔ载体上ꎬ送上海生工生物科技有限公司测序.将获得的序列翻译后与拟南芥ＡｔＳＹＰ１２２进行比对分析.将扩增获得的ＡｔＳＹＰ１２２在油菜中的同源基因序列翻译成氨基酸序列后ꎬ在ＳＭＡＲＴ(ｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍ￣ｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/)中分析其保守功能域ꎻ用在线软件ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ－ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ－ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕ￣ｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝％２ＦＮＰＳＡ％２Ｆｎｐｓａ＿ｓｅｃｃｏｎｓ.ｈｔｍｌ)预测分析其二级结构ꎻ同时ꎬ在ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＴＭＨＭＭ－２.０/中进行跨膜结构域的预测.１.２.２㊀表达载体的构建㊀根据Ｇａｔｅｗａｙ试剂盒说明书设计引物ꎬ两端加上接头ａｔｔＢꎬ以油菜ｃＤＮＡ为模板扩增获得油菜ＢｎＳＹＰ１２２基因全长.按照Ｇａｔｅｗａｙ试剂盒说明书将扩增到的ＰＣＲ产物通过ＢＰ反应连接到ｐＤＯＮＲ/Ｚｅｏ载体ꎬ并转化ＤＨ５α感受态ꎬ涂布于含Ｚｅｏｃｉｎ的ＬＢ培养基ꎬ３７ħ倒置培养ꎬ２０ｈ后挑选单克隆进行ＰＣＲ验证.将验证正确的转化子送上海生工生物科技有限公司测序.选择序列正确的单克隆ꎬ提取质粒进行ＬＲ反应ꎬ同样转化ＤＨ５α感受态并筛选转化子ꎬ将验证正确的转化子进一步采用冻融法转化农杆菌ＧＶ３１０１菌株.１.２.３㊀真空渗透法表达目的蛋白㊀挑取农杆菌单克隆置于含有５ｍＬＬＢ液体培养基和终浓度为５０ｎｇ ｍＬ－１卡那霉素的试管中ꎬ２８ħ㊁２００ｒ ｍｉｎ－１振荡培养３６ｈ后ꎬ以１ʒ１０００的比例转接至含有１５０ｍＬＬＢ液体培养基和终浓度为５０ｎｇ ｍＬ－１卡那霉素的锥形瓶中ꎬ继续培养至Ｄ６００ｎｍ为０.６~０.８ꎬ离心并收集菌体.然后用渗透缓冲液(１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭｇＣｌ２ꎬ１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭＥＳꎬ１５０μｍｏｌ Ｌ－１乙酰丁香酮ꎬ０.０２％ＳｉｌｗｅｔＬ￣７７)重悬ꎬ离心并重悬３次后ꎬ调节Ｄ６００ｎｍ为０.６ꎬ２８ħ静置２~３ｈ.将农杆菌悬浮液置于广口瓶或培养盒中与油菜并排放置在ＡＦ２０００真空抽滤器中ꎬ油菜的叶片向下浸入到农杆菌悬浮液中ꎬ打开真空泵ꎬ设置压力最大值为０.０６ＭＰａꎬ保持真空状态１５~２０ｍｉｎ.取出油菜植株并用吸水纸将叶片表面水分沾干ꎬ可观察到５０％油菜叶片出现水渍斑ꎬ黑暗条件下放置１２ｈ后ꎬ移到光照条件下正常培养２~３ｄ.１.２.４㊀激光共聚焦显微镜观察目的蛋白的表达情况㊀用刀片切取３ｍｍˑ３ｍｍ大小的侵染过农杆菌的油菜叶片ꎬ下表皮朝上置于载玻片ꎬ盖上盖玻片并在盖玻片与载玻片之间滴一滴无菌水ꎬ置于激光共聚焦显微镜下ꎬ在４８８ｎｍ激光下观察.１.２.５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证目的蛋白的表达情况㊀取２００ｍｇ油菜叶片于液氮中充分研磨ꎬ转移到２ｍＬＥＰ管中并加入１００μＬ蛋白提取缓冲液[５０ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)ꎬ１５０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＮａＣｌꎬ０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ０.５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ￣４０ꎬ０.２５％Ｎａ￣ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅꎬ１ˑ蛋白酶抑制剂]ꎬ充分涡旋混匀.１２０００ｒ ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎꎬ吸取上清液ꎬ等体积加入２ˑＳＤＳ蛋白上样缓冲液ꎬ煮沸１０ｍｉｎ变性.取２０μＬ蛋白样品跑ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ胶ꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ꎬ转膜后按照１ʒ５０００的比例加入ＧＦＰ羊抗鼠一抗进行杂交ꎬ随后以１ʒ８０００的比例加入辣根过氧化物酶(ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＨＲＰ)标记的二抗ꎬ将杂交后的膜加入ｗｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔＴＭＥＣＬ显影剂后在化学发光成像仪ｔａｎｏｎ￣５２００下观察.２㊀结果与分析２.１㊀油菜ＢｎＳＹＰ１２２蛋白的鉴定以拟南芥ＡｔＳＹＰ１２２的氨基酸序列为种子序列在已公布的油菜蛋白数据库中进行ＢＬＡＳＴ搜索ꎬ结果比对到与其同源性最高的蛋白序列ＢｎａＡ０４ｇ０５４７０Ｄ.根据此蛋白的基因序列设计引物ꎬ以油菜中双九号的ｃＤＮＡ为模板进行片段扩增并测序ꎬ经翻译后将其蛋白序列ＢｎＳＹＰ１２２＿ＺＳ９与数据库中的ＢｎａＡ０４ｇ０５４７０Ｄ㊁ＡｔＳＹＰ１２２进行多重序列比对分析.结果发现ꎬ扩增基因的蛋白序列与ＢｎａＡ０４ｇ０５４７０Ｄ存在４个氨基酸的差别(图１).但是ꎬ这２个蛋白序列与ＡｔＳＹＰ１２２的同源性高达８０.４％ꎬ并且都具有保守的ＳＮＡＲＥ结构域(ＳＮＡＲＥ￣ｄｏｍａｉｎ)(图１).这表明鉴定和扩增获得的蛋白是典型的ＳＮＡＲＥ蛋白ꎬ可能与ＡｔＳ￣ＹＰ１２２具有类似的功能ꎬ并将扩增获得的蛋白序列命名为ＢｎＳＹＰ１２２.黑色填充部分表示氨基酸序列完全相同ꎻ蓝色填充部分表示氨基酸序列有２个相同ꎻ黑色横线区域为ｔ￣ＳＮＡＲＥ保守基序ꎻ红色箭头指示ＢｎＳＹＰ１２２＿ＺＳ９与ＢｎＡ０４ｇ０５４７０Ｄ的差异氨基酸.图１㊀ＢｎＳＹＰ１２２和ＡｔＳＹＰ１２２的序列比对Ｆｉｇ.１㊀ＳｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＢｎＳＹＰ１２２ａｎｄＡｔＳＹＰ１２２ １６４ ㊀第４期许静等:甘蓝型油菜ＳＮＡＲＥ蛋白ＳＹＰ１２２叶片瞬时表达体系的建立２６４ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀２.２㊀ＢｎＳＹＰ１２２蛋白结构预测与分析ＳＭＡＲＴ预测表明ꎬＢｎＳＹＰ１２２Ｎ端的３９~１６５位氨基酸为ＳｙｎＮ结构域(图２Ａ㊁２Ｂ)ꎻ通过ＳＯＰＭＡ对其二级结构进行预测发现ꎬ在蛋白的Ｎ端依次排列着Ｈａ﹑Ｈｂ和Ｈｃ３个α￣螺旋束(图２Ｄ).这表明ＢｎＳ￣ＹＰ１２２是ＳＮＡＲＥ蛋白家族的突触融合(ｓｙｎｔａｘｉｎ)蛋白.在其Ｃ端的２８６~３０５位存在一个跨膜结构域(图２Ａ㊁２Ｂ)ꎬ表明ＢｎＳＹＰ１２２可能为跨膜蛋白ꎬ定位于细胞膜.为了确认其可靠性ꎬ使用ＴＭＨＭＭ２.０再次预测了ＢｎＳＹＰ１２２的跨膜结构域(图２Ｃ)ꎬ该结果与ＳＭＡＲＴ的预测结果一致.Ａ.ＳＭＡＲＴ预测的结构域示意图ꎻＢ.ＳＭＡＲＴ预测的结构域列表ꎻＣ.ＴＭＨＭＭ２.０预测的跨膜结构示意图ꎻＤ.ＳＯＰＭＡ预测的Ｎ端二级结构示意图.图２㊀ＢｎＳＹＰ１２２的结构域分析Ｆｉｇ.２㊀ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｎＳＹＰ１２２２.３㊀表达载体的构建与农杆菌转化以油菜中双九号的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ产物经１％琼脂糖凝胶电泳ꎬ检测到约１０００ｂｐ的目的条带(图３Ａ)ꎬ切胶回收后进行Ｇａｔｅｗａｙ入门反应ꎬ并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态.将Ｚｅｏｃｉｎ筛选的单克隆ꎬ以ｐＤＯＮＲ载体引物Ｍ１３￣Ｆ搭配片段引物ＢｎＳＹＰ１２２￣Ｒ进行ＰＣＲ验证ꎬ得到略大于１０００ｂｐ的条带(图３Ｂ).测序正确后提取质粒与载体ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４进行ＬＲ反应ꎬ转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态ꎬ挑选经卡那霉素筛选后的单克隆进行菌落ＰＣＲ验证ꎬ４个单克隆均扩增到约１０００ｂｐ的条带(图３Ｃ).提取质粒采用冻融法转化农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ卡那霉素和利福平筛选到的单克隆经ＰＣＲ验证为阳性克隆(图３Ｄ).以上结果表明ꎬｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４￣ＢｎＳＹＰ１２２重组载体构建成功ꎬ并转化获得农杆菌菌株ꎬ可用于下一步的油菜侵染试验.２.４㊀油菜叶片目的蛋白的荧光分析为了验证ＧＦＰ和目的蛋白ＢｎＳＹＰ１２２是否在油菜叶片中正常表达ꎬ使用激光共聚焦显微镜分别观察用真空渗透法表达ＧＦＰ和ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２的油菜叶片.如图４Ｂ所示ꎬ在处理的叶片细胞中可以观察到均匀分布的绿色荧光ꎬ表明外源基因可以在油菜叶片中正常翻译成蛋白.将ＢｎＳＹＰ１２２蛋白融合ＹＦＰ标签进行定位观察ꎬ结果显示ꎬ与位于细胞膜㊁细胞质及细胞核的ＧＦＰ相比ꎬＢｎＳＹＰ１２２明显定位于细胞膜(图４Ｃ)ꎬ与生物信息学预测结果一致.以上结果说明真空渗透法不仅能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白ꎬ还能够准确显示目的蛋白的亚细胞定位.２.５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证目的蛋白的表达为了进一步确定目的蛋白在油菜叶片中的正常表达ꎬ收集经含有ＧＦＰ和ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２表达载体的根癌农杆菌菌液真空渗透处理２ｄ的油菜叶片ꎬ提取总蛋白ꎬ用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测其蛋白表达量.结果显示ꎬ用ＧＦＰ抗体杂交后获得与目的蛋白大小一致的条带(图５)ꎬ说明真空渗透法确实能够正常表达目的蛋白.Ａ.ＢｎＳＹＰ１２２的扩增ꎬ其中Ｍ为ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎬ１－４为扩增到的ＰＣＲ片段ꎻＢ.ｐＤＯＮＲ/Ｚｅｏ￣ＢｎＳＹＰ１２２菌落ＰＣＲ验证ꎬ其中Ｍ为ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎬ１－４为大肠杆菌单克隆ꎻＣ.ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ１０４￣ＢｎＳＹＰ１２２菌落ＰＣＲ验证ꎬ其中Ｍ为ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎬ１－４为大肠杆菌单克隆ꎻＤ.菌落ＰＣＲ验证ＧＶ３１０１转化子ꎬ其中Ｍ为ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎬ１－４为农杆菌单克隆.图３㊀ＢｎＳＹＰ１２２的扩增及Ｇａｔｅｗａｙ法构建重组载体的验证Ｆｉｇ.３㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｎＳＹＰ１２２ａｎｄｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＧａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅＡ.未经处理的油菜叶片ꎻＢ.真空渗透表达ＧＦＰ的油菜叶片ꎻＣ.真空渗透表达ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２的油菜叶片.ＢＦ.明场ꎻＧＦＰ.绿色激发光场景ꎻＭｅｒｇｅ.融合明场和激发光场景.图４㊀激光共聚焦验证ＧＦＰ及ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２在油菜叶片中的瞬时表达Ｆｉｇ.４㊀ＴｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰａｎｄＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２ｉｎＢ.ｎａｐｕｓｌｅａｖｅｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｃｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒ ３６４㊀第４期许静等:甘蓝型油菜ＳＮＡＲＥ蛋白ＳＹＰ１２２叶片瞬时表达体系的建立Ａ.Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到的蛋白条带ꎻＢ.考马斯亮蓝染色的总蛋白.图５㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证ＧＦＰ和ＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２在油菜叶片中的表达Ｆｉｇ.５㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰａｎｄＹＦＰ￣ＢｎＳＹＰ１２２ｉｎＢ.ｎａｐｕｓｌｅａｖｅｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ３㊀讨论农杆菌介导的瞬时表达体系建立方法主要包括注射法和真空侵染法ꎬ２种方法在烟草中均能取得较高的表达效率.有报道称ꎬ由于油菜叶片特殊结构及叶脉的影响ꎬ农杆菌注射法无法在油菜叶片中取得较好的表达效果ꎬ而在子叶中可以成功完成瞬时表达[６].作者初期采用注射法在油菜叶片中表达ＧＦＰ蛋白ꎬ效果也不理想.成熟植株的叶片具有更容易操作㊁表达蛋白获得量大㊁有利于后期功能研究等优势ꎬ因此ꎬ本研究测试真空侵染法是否能在油菜叶片中表达报告基因ＧＦＰ和ＹＦＰ融合的ＳＮＡＲＥ蛋白ＢｎＳＹＰ１２２.采用烟草的真空侵染体系ꎬ参考油菜的稳定表达方法ꎬ渗透缓冲液在ＭＭＡ(１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭｇＣｌ２ꎬ１０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＭＥＳꎬ１５０μｍｏｌ Ｌ－１乙酰丁香酮)的基础上ꎬ加入了ＳｉｌｗｅｔＬ￣７７辅助侵染[１９].采用真空侵染法在烟草叶片中表达外源蛋白ꎬ当压力为０.０６ＭＰａ时ꎬ只需要１~３ｍｉｎ就可以完成[２０－２１]ꎻ而在油菜中双九号的叶片中ꎬ至少需要１０ｍｉｎ.这说明农杆菌侵入油菜叶片比侵入烟草困难ꎬ因此ꎬ注射法无法取得较好的表达效果.真空侵染的最适时间与油菜苗龄和长势关系密切ꎬ４周龄的油菜叶片经真空侵染１５~２０ｍｉｎ可取得较好的效果ꎬ超过２５ｍｉｎ可能导致叶片细胞坏死㊁萎蔫.农杆菌的菌液浓度与转化效率关系密切ꎬ浓度过高可能导致植物叶片萎蔫ꎬ过低则转化效率较低[６].本研究参考子叶瞬时表达设置农杆菌Ｄ６００ｎｍ为０.６~０.８ꎬ取得了较好的表达效果.通过农杆菌介导的真空侵染法将ＢｎＳＹＰ１２２基因在油菜叶片中成功瞬时表达ꎬ并应用此方法成功表达了油菜的外源基因ＧＦＰ.据报道ꎬＳＹＰ１２２定位于质膜[２２]ꎬ其所在亚家族Ｑａ￣ＳＮＡＲＥ共同的结构特征为一个Ｎ端的３个螺旋束(Ｈａ㊁Ｈｂ㊁Ｈｃ)㊁一个由６０~７０个氨基酸组成的ＳＮＡＲＥ保守基序㊁一个Ｌｉｎｋｅｒ和位于Ｃ端的跨膜结构域[１１].这与本试验结果高度一致ꎬ说明本研究建立的农杆菌真空侵染法不仅能够快速㊁方便地表达目的蛋白ꎬ还能够精准地观察目的蛋白的亚细胞定位.参考文献[１]沈金雄ꎬ傅廷栋.我国油菜生产㊁改良与食用油供给安全[Ｊ].中国农业科技导报ꎬ２０１１ꎬ１３(１):１－８.[２]联合国粮食及农业组织.２０１７年中国油菜的种植面积及产量数据[ＥＢ/ＯＬ].(２０１９－０１－１８)[２０１９－０３－２８].ｈｔｔｐ://ｆａｏｓｔａｔ３.ｆａｏ.ｏｒｇ.[３]谭小力ꎬ孔凡明ꎬ张丽丽ꎬ等.蓝细菌血红蛋白基因的克隆及其向甘蓝型油菜中的转化[Ｊ].作物学报ꎬ２００９ꎬ３５(１):６６－７０.[４]涂世伟ꎬ郭万里ꎬ蒋立希ꎬ等.油菜遗传转化方法的研究进展[Ｊ].浙江师范大学学报(自然科学版)ꎬ２０１２ꎬ３５(３):３３８－３４５.[５]孙洁ꎬ黄团ꎬ李加纳ꎬ等.农杆菌培养方式和预培养基激素配比对甘蓝型油菜下胚轴转化效应分析[Ｊ].西南大学学报(自然科学版)ꎬ２００７ꎬ２９(１２):４９－５３.[６]ＨＯＲＳＣＨＲＢꎬＦＲＹＪＥꎬＨＯＦＦＭＡＮＮＮＬꎬｅｔａｌ.Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｔｏｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｓｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ１９８５ꎬ２２７:１２２９－１２３１. ４６４ 福建农林大学学报(自然科学版)第４８卷㊀[７]谭小力ꎬ诸葛锐军ꎬ李冠英ꎬ等.农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达[Ｊ].生物学杂志ꎬ２０１２ꎬ２９(６):９３－９６.[８]ＧＬＥＢＡＹꎬＫＬＩＭＹＵＫＶꎬＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴＳ.Ｍａｇｎｉｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｅｗｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２００５ꎬ２３(１７):２０４２－２０４８.[９]滕蕾ꎬ黄瑾ꎬ赵竹露ꎬ等.Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ操纵子在甘蓝型油菜和拟南芥中的瞬时表达[Ｊ].四川大学学报(自然科学版)ꎬ２００６ꎬ４３(６):１３９４－１３９８.[１０]ＣＯＬＬＩＮＳＮＣꎬＴＨＯＲＤＡＬ￣ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮＨꎬＬＩＰＫＡＶꎬｅｔａｌ.ＳＮＡＲＥ￣ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｔｔｈｅｐｌａｎｔｃｅｌｌｗａｌｌ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００３ꎬ４２５:９７３－９７７.[１１]ＬＩＰＫＡＶꎬＫＷＯＮＣꎬＰＡＮＳＴＲＵＧＡＲ.ＳＮＡＲＥ￣ｗａｒｅ:ｔｈｅｒｏｌｅｏｆＳＮＡＲＥ￣ｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅ￣ｖｉｅｗｏｆＣｅｌｌａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ２３:１４７－１７４.[１２]ＥＬＫＡＳＭＩＦꎬＫＲＡＵＳＥＣꎬＨＩＬＬＥＲＵꎬｅｔａｌ.ＳＮＡＲＥｃｏｍｐｌｅｘｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｊｏｉｎｔｌｙｍｅｄｉａｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ２４:１５９３－１６０１.[１３]ＺＨＡＮＧＺꎬＦＥＥＣＨＡＮＡꎬＰＥＤＥＲＳＥＮＣꎬｅｔａｌ.ＡＳＮＡＲＥ￣ｐｒｏｔｅｉｎｈａｓｏｐｐｏｓｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｄｅ￣ｆｅｎｃｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００７ꎬ４９:３０２－３１２.[１４]ＡＳＳＡＡＤＦＦꎬＱＩＵＪＬꎬＹＯＵＮＧＳＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＰＥＮ１ｓｙｎｔａｘｉｎｄｅｆｉｎｅｓａｎｏｖｅｌｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｕｐｏｎｆｕｎｇａｌａｔｔａｃｋａｎｄｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｔｉｍｅｌｙａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｐａｐｉｌｌａｅ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ１５:５１１８－５１２９.[１５]ＰＡＪＯＮＫＳꎬＫＷＯＮＣꎬＣＬＥＭＥＮＳＮꎬｅｔａｌ.ＡｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＰＥＮ１ｓｙｎｔａｘｉｎｉｎｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００８ꎬ２８３:２６９７４－２６９８４.[１６]ＫＡＲＮＩＫＲꎬＺＨＡＮＧＢꎬＷＡＧＨＭＡＲＥＳꎬｅｔａｌ.ＢｉｎｄｉｎｇｏｆＳＥＣ１１ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｔｓｒｏｌｅｉｎＳＮＡＲＥｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｆｔｅｒｖｅｓｉｃｌｅｆｕｓｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｔｗｏｐａｔｈｗａｙｓｆｏｒｖｅｓｉｃｕｌａｒｔｒａｆｆｉｃｔｏｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１５ꎬ２７(３):６７５－６９４.[１７]ＷＡＧＨＭＡＲＥＳꎬＬＩＬＥＩＫＹＴＥＥꎬＫＡＲＮＩＫＲＡꎬｅｔａｌ.ＳＮＡＲＥｓｓｙｎｔａｘｉｎｏｆｐｌａｎｔｓ１２１(ＳＹＰ１２１)ａｎｄＳＹＰ１２２ｍｅｄｉａｔｅｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｄｉｓｔｉｎｃｔｃａｒｇｏｓｕｂｓｅｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７８(４):１６７９－１６８８.[１８]王汉中ꎬ刘贵华ꎬ郑元本.抗菌核病双低油菜 中双９号[Ｊ].农技服务ꎬ２００３(６):１９－２０.[１９]王道杰ꎬ杨翠玲ꎬ陆鸣.真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选[Ｊ].植物学报ꎬ２００９ꎬ４４(２):２１６－２２２.[２０]杨丽萍ꎬ金太成ꎬ徐洪伟ꎬ等.植物中瞬时表达外源基因的新型侵染技术[Ｊ].遗传ꎬ２０１３ꎬ３５(１):１１１－１１７.[２１]金太成ꎬ孟大伟ꎬ刘璐ꎬ等.利用叶片真空渗透法表达外源蛋白ＧＦＰ[Ｊ].吉林农业科技学院学报ꎬ２０１５ꎬ２４(４):４０－４２.[２２]ＡＮＤＥＲＳＥＮＴＧꎬＮＡＳＥＥＲＳꎬＵＲＳＡＣＨＥＲꎬｅｔａｌ.Ｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐｒｏｄｕｃｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍａｌｓｙｍｍｅ￣ｔｒｙａｎｄｐａｓｓａｇｅｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１８ꎬ５５５:５２９－５３３.(责任编辑:杨郁霞)㊀㊀５６４ ㊀第４期许静等:甘蓝型油菜ＳＮＡＲＥ蛋白ＳＹＰ１２２叶片瞬时表达体系的建立。
