RFLP限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。

碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。

用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。

三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。

对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。

为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。

无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。

(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。

目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。

该步骤必须保证酶解完全。

如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。

酶解的时间根据实际情况而定。

(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。

电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

时间由几小时到24小时不等。

(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。

常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。

转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。

转印的方法一般有三种。

根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。

1 盐桥法；也叫毛细管转移法。

先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。

第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。

动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。

提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。

mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。

在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。

更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。

生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。

ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。

强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。

如何用PCR法检测基因的多态性多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。

在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。

这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。

基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，钠问亢兔扛銎蔚某ざ染筒煌此降南拗菩云纬ざ榷嗵裕贾孪拗破纬ざ确⑸谋涞拿盖形坏悖殖莆嗵晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。

现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。

相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。

在电泳时泳动的速度不同。

将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。

在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。

其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。

突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。

RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。

下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。

RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。

它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。

RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。

2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。

限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。

如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。

3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。

4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。

RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。

通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。

2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。

通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。

3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。

4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。

rflp的基本原理RFLP是指限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism），是一种基于DNA序列的分子生物学技术。

它可以检测DNA序列中存在的多态性，即不同个体之间的DNA序列差异。

RFLP技术被广泛应用于基因组学、遗传学、医学等领域。

一、RFLP的基本概念1.1 限制性酶限制性酶又称为切割酶，是一种能够识别特定DNA序列并将其切割成特定长度片段的酶。

1.2 片段长度多态性片段长度多态性指的是同一基因在不同个体中由于存在不同位点上的限制性酶切割位点而产生不同大小的DNA片段。

二、RFLP技术流程2.1 DNA提取和纯化首先需要从样品中提取出DNA，并进行纯化处理，以保证后续实验中得到高质量的DNA样品。

2.2 限制性酶切割将提取出来的DNA与特定的限制性酶进行反应，使其在特定位点上进行切割形成DNA片段。

2.3 凝胶电泳分离将反应后得到的DNA片段通过凝胶电泳进行分离，根据片段长度的不同，在凝胶中形成不同大小的DNA条带。

2.4 转膜将凝胶上的DNA条带转移到膜上，以便进行进一步的检测和分析。

2.5 探针杂交使用特定的DNA探针与转移后的DNA片段进行杂交反应，通过探针与DNA片段之间的互补配对来检测目标基因是否存在多态性。

2.6 检测和分析通过显色、放射自显影等方法来检测和分析DNA条带，确定目标基因在不同个体中是否存在多态性。

三、RFLP技术优缺点3.1 优点（1）可以检测到基因组中存在的多态性，有助于研究遗传疾病、物种起源等问题；（2）技术成熟，操作简单易行；（3）对样品来源没有特殊要求，可以从各种生物体中提取DNA样品进行检测。

3.2 缺点（1）需要使用大量限制性酶，并且每个限制性酶只能识别特定的DNA序列，对于大规模筛查较为困难；（2）需要使用放射性标记的探针进行检测，存在一定的危险性；（3）需要较长时间进行实验操作，不适用于快速筛查。