限制性片段长度多态性 RFLP课件

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第二章基因组多态性

1. 小卫星DNA的特点同一HVR的重复单位具有高度保守性。
在不同的个体或同一个体的同源染色体之间，重复单位的重复次数不同，构成众多等位基因。
经酶切、电泳、变性、印迹、重复序列杂交、冲洗、显影后表现为丰富多彩的 RFLPs。
同一个体不同组织来源的RFLP谱带完全一样；而不同个体的谱带的位置和宽度千差万别，可称为DNA指纹。
一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP ）
使用某种限制性内切酶酶切不同个体的DNA分子后，个体之间酶切片段长度的差异性即限制性片段长度多态性。
限制性内切酶(restriction endonuclease) 酶主要分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶基因工程中常用的作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等水解酶分为内切酶和外切酶内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸
不同的个体或群体有不同的DNA 指纹图。英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图的概率为3000亿分之一，两个同胞个体具有相同图谱的概率也仅仅为200 万分之一。
2. 小卫星DNA与人类白细胞抗原多态性比较
HLA呈单倍型遗传
小卫星DNA非单倍型遗传小卫星 DNA 的基因散在分布在多条染色体上，多对染色体的分离和自由组合，使得同胞中也无相同的。
小卫星DNA的本质
由一些约十多个或几十个 bp 的短序列（即重复单位）串联重复而成。如： GGTTCTTAAAAAGGTTCTTAAAAA----GGTTCTTAAAAAGGTTCTTAAAAA 不同的个体或同一个体的两条同源染色体之间，重复次数可能并不相同。区别于存在于着丝粒、端粒和Y长臂的重复序列，称为小卫星DNA。又称其为可变数目串联重复序列（VNTR）。

形态学标记

1997 年9 月,大肠杆菌的完整基因图谱已绘制成功, 基因组全序列完成, 全长为 5Mb ,共有4 288 个基因,同时也搞清了所有基因产物的氨基酸序列.

啤酒酵母，1997年，第一个真核生物基因组图谱公布。
秀丽线虫( caenorhabditis elegans) 1998 年12 月完成了基因组测序。基因组大小 100 Mb ,分布于6 条染色体,预测有19，099 个基因。
分布广泛均匀多态信息含量丰富呈共显性遗传稳定性好，可比性强分析技术易于实现自动化开发成本高

微卫星标记的应用领域

遗传图谱的构建连锁分析特殊的基因（如致病基因）姻亲分析样品鉴定（如父本分析、血缘分析、等号样品分析、杂种分析）物种和居群的遗传多样性群体遗传学分析（如有效群体大小、群体遗传结构、群体分化、迁移与基因流动）保护生物学

(1) 小卫星 (minisatellite DNA)
小卫星重复单位的核心序列为15一76bp 近缘物种和个体间的小卫星核心序列有着一定的同源性，在一定的条件下可以相互杂交。

DNA指纹图谱原理
①选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度的片段 ②以VNTR中特异序列作为探针，进行 Southern杂交， ③由于不同个体的串联重复序列的数目和位置不同，形成的杂交谱带具有个体的特异性，人们称为DNA指纹图谱 (DNA fingerprinting, DFP)
single nucleotide polymorphism 是指染色体上的某个存在单个碱基的变化，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等。

T-RFLP

T-RFLP技术
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差异。
下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序，用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个同组样本的图谱，波峰大致上是相同的，这样表明这两个样本数据是比较可靠的。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。

特种医学课件-DNA长度多态性

20 ng
Unknown Samples ~2.5 ng
Calibration standards
0.63 ng
10 ng 5 ng
2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng
1.25 ng 2.5 ng 5 ng 10 ng 20 ng
琼脂糖凝胶电泳结合GoldView荧光燃料测定
11
12
三、DNA纯化
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）, 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus 公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。
1
DNA多态性分析技术
长度多态性
序列多态性
VNTR/小
STR/微卫
mtDNA
SNP
卫星DNA 星DNA
RFLP DNA指纹 Amp-FLP MVR-PCR
Amp-FLP/STR-PCR
DNA提取/纯化/ 定量，PCR及其产物的检测
RFLP-PCR、ASO-PCR DHPLC、SSCP MALDI-TOF MVR-PCR、DNA Chip Sequencing，et al
[提取步骤] 溶血，然后加入NaOH ，80℃孵育10 min ，离心，保存上清液。
8
Chelex-100法：操作简单快速，检材用量少，一管到底，样本DNA损失小，样本差错概率小；不能用紫外法和凝胶电泳法定量，干扰抑制物未去除。
酚/氯仿法：稳定，纯度高；繁复，试剂毒性，检材用量大，样本DNA损失多，样本差错概率大。

遗传多样性的分子检测PPT.

RAPD
局限性： ①它呈显性遗传标记（极少数共显性），不能有效区分杂合子和纯合子。
②易受反应条件的影响，某些情况下，重复性较差，可靠性较低，对反应的微小变化十分敏感。如聚合酶的来源，DNA不同提取方法，Mg2+离子浓度等都需要严格控制。
扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。
根据依赖的技术手段的不同，DNA分子标记可分为3大类： ➢第一类是以杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多态性（RFLP）标记、数目可变串联重复多态性（VNTR）标记； ➢第二类是基于PCR技术为基础的分子标记，如随机扩增多态性 DNA（RAPD）标记、任意RCP（AP-PCR）标记、DNA指纹（DAF）标记、序列特征化扩增区域（SCAR）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）标记、简单重复序列（SSR）标记、内部简单重复序列（ISSR）标记等； ➢第三类是基于测序和DAN芯片技术为基础的分子标记，如表达序列标签（EST）标记和单核苷酸多态性（SNP）标记等。
理想的DNA分子标记应具备的特点 ①遗传多样性高 ②共显性遗传 ③在基因组中大量存在且分布均匀 ④表现为“中性”，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁 ⑤稳定性、重现性高 ⑥信息量大，分析效率高 ⑦检测手段简单快捷，易于实现自动化 ⑧开发成本和使用成本低
限制性片段长度多态性（RFLP）标记
EST作用具体表现在： ① 用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱； ② 作为探针用于放射性杂交； ③ 用于定位克隆； ④ 借以寻找新的基因； ⑤ 作为分子标记； ⑥ 用于研究生物群体多态性； ⑦ 用于研究基因的功能； ⑧ 有助于药物的开发、品种的改良； ⑨ 促进基因芯片的发展等方面。

rflp原理

rflp原理RFLP原理。

RFLP（Restrition Fragment Length Polymorphism）是一种分子生物学技术，它是利用限制性内切酶切割DNA，通过分析DNA的特定序列长度差异来进行基因分型和遗传多态性研究的方法。

RFLP 技术在基因组学研究、疾病诊断和法医学鉴定等领域有着广泛的应用。

首先，RFLP技术的原理是基于DNA序列的差异性。

DNA序列中存在着许多的限制性内切酶切位点，当DNA经过限制性内切酶的切割作用后，会产生不同长度的DNA片段。

这些不同长度的DNA片段就构成了RFLP技术的研究对象。

而DNA序列的差异性来源于基因组中的多态性位点，即在不同个体中，同一位点上的DNA序列存在着不同的碱基组成，从而导致了限制性内切酶切割后的DNA片段长度差异。

其次，RFLP技术的步骤包括DNA提取、限制性内切酶切割、电泳分离和杂交探针检测。

首先是DNA提取，从样本中提取出待研究的DNA，然后通过限制性内切酶切割，将DNA切割成不同长度的片段。

接着是电泳分离，将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据不同长度的片段在凝胶中的迁移速度来进行分离。

最后是杂交探针检测，将特定的DNA探针与目标DNA片段进行杂交，通过探针的特异性结合来检测目标DNA片段的存在与否。

再次，RFLP技术的应用非常广泛。

在基因组学研究中，RFLP技术可以用于构建遗传图谱、进行基因定位和克隆等研究。

在疾病诊断中，RFLP技术可以用于检测遗传病变和基因突变，对于一些遗传性疾病的诊断具有重要意义。

在法医学鉴定中，RFLP技术可以通过DNA指纹分析来进行个体识别和亲子鉴定，为司法鉴定提供了可靠的技术手段。

最后，RFLP技术虽然在过去曾经是基因分型和遗传多态性研究的主要方法，但随着PCR技术和基因芯片技术的发展，RFLP技术的应用逐渐减少。

然而，RFLP技术仍然具有一定的优势，例如在一些特定的基因分型和遗传多态性研究中，RFLP技术仍然是不可替代的。

RFLP,SNP标记

位于基因组内的SNP可以分为2种形式: 一是基因编码区的突变 ,主要分布于基因编码区内(coding region) ,故又称其为cSNP; 二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异 , 又分为基因周边SNP (peripheral SNP, pSNP) 及基因间SNP ( intronic SNP, iSNP) .研究表明基因周边SNP频率比基因编码区SNP频率高。
SNP的检测方法分成四大类: （一）基因芯片技术基因芯片技术：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。（二）Taqman技术在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，他们分别与两个等位基因完全配对。探针运用了荧光共振能量转换技术，探针的5’端和3’端分别用特殊染料标记，称为供体受体染料对或爆-猝灭燃料对。

RFLP的应用
3.遗传多态性分析运用RFLP技术可以尽可能多地保存那些在已知位点上有异态的品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA 序列自然变异的直接检测，只需选择适当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记，因而对植物不同种属或杂种后的的细胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵活性和灵敏性。因而能较好地应用于细胞质遗传的研究。 ←
1.遗传学图的构建结合RFLP连锁图，任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地进行转移。 2.基因定位利用RFLP技术能够准确地标记定位种质中的目标基因，结合杂交，回交及组织培养等技术就可以快速有效的将所需目标基因的DNA片段引入栽培品种中，实现品种改良。
优点：（1）SNP具有共显性，能获得的标记数量多，易于实现高通量。（2）SNP是基因组中最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。缺点:芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。

研究生实验PCR检测apoB基因多态性ppt课件

（1.5%胶，100V, 1小时）
紫外灯下检测
（apoB基因PCR产物：双条带或单条带， 700bp左右）
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1. 电泳前准备
准备内容
作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer
防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。
DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
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1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
• 1 DNA分子的大小：分子量越大，迁移速度越慢； • 2 构象：共价闭环DNA分子>直线DNA>开环双链DNA； • 3 凝胶浓度：浓度越大，孔径越小，DNA分子迁移越慢； • 4 电压：电压越高， DNA分子迁移越快； • 5 缓冲液：碱性环境保证DNA分子带负电板用量—— Plasmid:1ng, Chromosome:300-500 ng, 一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。
（2）可选DNA—— 质粒、噬菌体、染色体DNA 注意：防止交叉污染
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4. dNTP
（1）四种脱氧核苷酸，基本原料,四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应
4
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
5
2 实验材料及试剂
琼脂糖电泳缓冲液：1TAE（Tris acetate-EDTA buffer ） 6加样缓冲液（溴酚蓝/二甲苯青/甘油） EB染色液（溴化乙锭，ethidium bromide）

PCR-RFLP

PCR-RFLP
CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites) CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应
（PCR-RFLP）技术。

是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。

CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。

但在多倍体植物中的应用有一定的局限性。

另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。

原理
PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。

不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。

此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。

基本流程
1.根据基因名称查询序列，设计引物。

2.提取基因组DNA。

3.PCR扩增。

4.产物酶切，凝胶电泳。

优点
这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。

RFLP技术

RFLP技术遗传分析的根本方法是DNA水平的分析，可分为两种方法：直接对DNA全部碱基序列的分析和DNA部分碱基序列的分析。

从原理上可分为两类：直接测序，主要是分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列；另一类是检测基因组的一批识别位点，如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析，DNA指纹分析和随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA）技术等RFLP技术是用特定的方法将核（n）DNA,叶绿体（cp）DNA,线粒体（mt）DNA或总DNA，cDNA（用特定基因克隆片段作为探针来检测生物基因组），MHC（主要相容性复合体）提取出来，用限制性内切酶消化后，直接或间接地得出酶切片段在长度和数量上的差异。

限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）是指用限制性内切酶消化不同基因型的DNA后产生的酶切片段在长度和数量上的差异。

它的分子基础是核苷酸序列出现碱基代替或插入／缺失及倒位分子重排事件，而导致限制性切点或获得。

在遗传多态性研究中，常用于RFLP 分析的DNA分子主要有：cpDNA(叶绿素)、mtDNA、Rdna（核糖体DNA），单拷贝基因以及变相基因等。

方法是将上述DNA之一，用限制性酶切消化，电泳印迹，再用DNA探针杂交，从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。

对于特定基因和DNA片段而言，还可采用PCR技术将目的DNA扩增至百万倍后直接酶切观察，使方法更为简便，节省和安全。

随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA，RAPD）技术是1990年出现的一项新技术，该技术通过PCR进行DNA扩增，所用引物是G＋C含量为50～70％的单个随机引物，这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA的互补序列配对，启动DNA的合成。

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