RFLP限制性片段长度多态性

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在进行 RFLP（限制性片段长度多态性）分析之前，需要进行充分的准备工作。

T-RFLP简介
T-RFLP中文可翻译为：末端限制性片段长度多样性，又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。

是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，日亦受到研究人员的重视。

该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。

T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光
物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。

提取待分析样的中DNA，以他为模板进行PCR扩张，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适
的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。

由于在不同
细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。

消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。

因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。

这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大。

如何用PCR法检测基因的多态性多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。

在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。

这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。

基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，钠问亢兔扛銎蔚某ざ染筒煌此降南拗菩云纬ざ榷嗵裕贾孪拗破纬ざ确⑸谋涞拿盖形坏悖殖莆嗵晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。

现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。

相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。

在电泳时泳动的速度不同。

将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。

在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。

其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。

突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。

一、基本原理限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。

不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。

在同源染色体相应的DNA区段，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。

这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。

它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。

二、RFLP技术的基本步骤这一技术主要包括三大步骤：1、靶DNA的准备先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。

2、核酸探针的标记将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。

探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。

3、杂交显示将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分析。

rflp原理RFLP原理。

RFLP（Restrition Fragment Length Polymorphism）是一种分子生物学技术，它是利用限制性内切酶切割DNA，通过分析DNA的特定序列长度差异来进行基因分型和遗传多态性研究的方法。

RFLP 技术在基因组学研究、疾病诊断和法医学鉴定等领域有着广泛的应用。

首先，RFLP技术的原理是基于DNA序列的差异性。

DNA序列中存在着许多的限制性内切酶切位点，当DNA经过限制性内切酶的切割作用后，会产生不同长度的DNA片段。

这些不同长度的DNA片段就构成了RFLP技术的研究对象。

而DNA序列的差异性来源于基因组中的多态性位点，即在不同个体中，同一位点上的DNA序列存在着不同的碱基组成，从而导致了限制性内切酶切割后的DNA片段长度差异。

其次，RFLP技术的步骤包括DNA提取、限制性内切酶切割、电泳分离和杂交探针检测。

首先是DNA提取，从样本中提取出待研究的DNA，然后通过限制性内切酶切割，将DNA切割成不同长度的片段。

接着是电泳分离，将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据不同长度的片段在凝胶中的迁移速度来进行分离。

最后是杂交探针检测，将特定的DNA探针与目标DNA片段进行杂交，通过探针的特异性结合来检测目标DNA片段的存在与否。

再次，RFLP技术的应用非常广泛。

在基因组学研究中，RFLP技术可以用于构建遗传图谱、进行基因定位和克隆等研究。

在疾病诊断中，RFLP技术可以用于检测遗传病变和基因突变，对于一些遗传性疾病的诊断具有重要意义。

在法医学鉴定中，RFLP技术可以通过DNA指纹分析来进行个体识别和亲子鉴定，为司法鉴定提供了可靠的技术手段。

最后，RFLP技术虽然在过去曾经是基因分型和遗传多态性研究的主要方法，但随着PCR技术和基因芯片技术的发展，RFLP技术的应用逐渐减少。

然而，RFLP技术仍然具有一定的优势，例如在一些特定的基因分型和遗传多态性研究中，RFLP技术仍然是不可替代的。

RFLP技术遗传分析的根本方法是DNA水平的分析，可分为两种方法：直接对DNA全部碱基序列的分析和DNA部分碱基序列的分析。

从原理上可分为两类：直接测序，主要是分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列；另一类是检测基因组的一批识别位点，如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析，DNA指纹分析和随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA）技术等RFLP技术是用特定的方法将核（n）DNA,叶绿体（cp）DNA,线粒体（mt）DNA或总DNA，cDNA（用特定基因克隆片段作为探针来检测生物基因组），MHC（主要相容性复合体）提取出来，用限制性内切酶消化后，直接或间接地得出酶切片段在长度和数量上的差异。

限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）是指用限制性内切酶消化不同基因型的DNA后产生的酶切片段在长度和数量上的差异。

它的分子基础是核苷酸序列出现碱基代替或插入／缺失及倒位分子重排事件，而导致限制性切点或获得。

在遗传多态性研究中，常用于RFLP 分析的DNA分子主要有：cpDNA(叶绿素)、mtDNA、Rdna（核糖体DNA），单拷贝基因以及变相基因等。

方法是将上述DNA之一，用限制性酶切消化，电泳印迹，再用DNA探针杂交，从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。

对于特定基因和DNA片段而言，还可采用PCR技术将目的DNA扩增至百万倍后直接酶切观察，使方法更为简便，节省和安全。

随机扩增多态DNA（Random Amplified Polymophism DNA，RAPD）技术是1990年出现的一项新技术，该技术通过PCR进行DNA扩增，所用引物是G＋C含量为50～70％的单个随机引物，这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA的互补序列配对，启动DNA的合成。