10 限制性片段长度多态性实验(RFLP)

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。

碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。

用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。

三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。

对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。

为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。

无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。

(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。

目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。

该步骤必须保证酶解完全。

如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。

酶解的时间根据实际情况而定。

(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。

电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

时间由几小时到24小时不等。

(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。

常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。

转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。

转印的方法一般有三种。

根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。

1 盐桥法；也叫毛细管转移法。

先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。

基因工程习题及参考答案02工具酶部分——限制性内切核酸酶一、填空题1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。

基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。

2．年Luria 和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。

3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。

5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。

它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合双链。

这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。

切割的方式有，产生末端的DNA 片段或的DNA片段。

作用时需要作辅助因子，但不需要和。

6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)(2) 。

7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。

根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。

8．EcoK 是I 类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。

在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。

9．个体之间DNA 限制性片段长度的差异叫。

10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。

11．限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。

限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。

它是第一代DNA分子标记技术。

Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。

DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。

RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。

所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。

当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。

分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。

分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。

不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。

常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。

分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。

构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。

1 原理该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。

如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。

第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。

基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。

2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。

3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。

5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。

它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。

切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。

作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。

8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。

11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。

DNA鉴定方法DNA鉴定方法DNA鉴定是一种通过对DNA序列的比较分析，确定个体之间的亲缘关系或确认身份的方法。

DNA鉴定在刑侦、亲子鉴定、遗传病诊断等领域有广泛应用。

本文将介绍DNA鉴定的基本原理和常用方法。

DNA鉴定的原理在于人类DNA的独特性和遗传性。

DNA是一种包含遗传信息的分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们按照一定的规则排列成两条螺旋状的链。

每个人的DNA序列都是独一无二的，除了一些双胞胎之外。

鉴定方法主要利用DNA的这种独特性，通过比较个体的DNA序列，确定是否具有亲缘关系或是否为同一人。

常用的DNA鉴定方法包括：1. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：RFLP分析是DNA鉴定的经典方法之一。

它通过利用限制性内切酶将DNA切割成多个不同长度的片段，然后使用凝胶电泳将这些片段进行分离，并利用射入探针的杂交方法进行检测。

不同个体之间的DNA序列差异会导致不同的片段长度，从而可以通过比较片段长度来确定个体之间的亲缘关系。

2. PCR（聚合酶链式反应）分析：PCR是一种快速有效的DNA复制技术，可以从微量DNA中扩增出足够数量的DNA片段用于分析。

PCR分析常用于亲子鉴定、法医学和遗传病诊断。

PCR分析通常配合其他技术如序列分析、飞行时间质谱和DNA芯片等来进行。

3. STR（短串联重复）分析：STR分析是目前最常用的DNA 鉴定方法之一。

STR序列是由2-6个碱基重复单元组成的，不同个体之间的STR序列重复单元数目存在差异。

STR分析通过PCR扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分离，并通过比较STR重复单元数目来鉴定个体之间的亲缘关系或身份。

DNA鉴定的过程包括取样、提取DNA、扩增DNA片段、分离和检测。

取样可以采用血液、口腔拭子、毛发等样品。

提取DNA需要将样品中的DNA从细胞核和细胞器中分离出来。

DNA扩增通过PCR技术，可以在短时间内从微量DNA样品中复制出大量DNA片段。

RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。

下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。

RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。

它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。

RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。

2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。

限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。

如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。

3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。

4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。

RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。

通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。

2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。

通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。

3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。

4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。

rflp的基本原理RFLP是指限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism），是一种基于DNA序列的分子生物学技术。

它可以检测DNA序列中存在的多态性，即不同个体之间的DNA序列差异。

RFLP技术被广泛应用于基因组学、遗传学、医学等领域。

一、RFLP的基本概念1.1 限制性酶限制性酶又称为切割酶，是一种能够识别特定DNA序列并将其切割成特定长度片段的酶。

1.2 片段长度多态性片段长度多态性指的是同一基因在不同个体中由于存在不同位点上的限制性酶切割位点而产生不同大小的DNA片段。

二、RFLP技术流程2.1 DNA提取和纯化首先需要从样品中提取出DNA，并进行纯化处理，以保证后续实验中得到高质量的DNA样品。

2.2 限制性酶切割将提取出来的DNA与特定的限制性酶进行反应，使其在特定位点上进行切割形成DNA片段。

2.3 凝胶电泳分离将反应后得到的DNA片段通过凝胶电泳进行分离，根据片段长度的不同，在凝胶中形成不同大小的DNA条带。

2.4 转膜将凝胶上的DNA条带转移到膜上，以便进行进一步的检测和分析。

2.5 探针杂交使用特定的DNA探针与转移后的DNA片段进行杂交反应，通过探针与DNA片段之间的互补配对来检测目标基因是否存在多态性。

2.6 检测和分析通过显色、放射自显影等方法来检测和分析DNA条带，确定目标基因在不同个体中是否存在多态性。

三、RFLP技术优缺点3.1 优点（1）可以检测到基因组中存在的多态性，有助于研究遗传疾病、物种起源等问题；（2）技术成熟，操作简单易行；（3）对样品来源没有特殊要求，可以从各种生物体中提取DNA样品进行检测。

3.2 缺点（1）需要使用大量限制性酶，并且每个限制性酶只能识别特定的DNA序列，对于大规模筛查较为困难；（2）需要使用放射性标记的探针进行检测，存在一定的危险性；（3）需要较长时间进行实验操作，不适用于快速筛查。