限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。

它是第一代DNA分子标记技术。

Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。

DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。

RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。

所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。

当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。

分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。

分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。

不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。

常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。

分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。

构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。

1 原理该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。

如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。

第9章 动物DNA限制性片段长度多态性分析9.1 动物DNA限制性片段长度多态性基本概况DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）是进行动物物种分化和群体遗传多样性研究的一项重要经典技术，而线粒体DNA和核糖体DNA 则是动物RFLP研究中最为常用的两种遗传标记（Nei，Tajima 1981）。

动物线粒体DNA是一种共价闭环的环状双链DNA，具有严格的母系遗传方式，每个细胞中有 1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离、提纯（Brown等 1979；Avise等 1983；Lansman 1983）。

提取线粒体DNA的实验技术比较简单，且重复性好（王文，施立明 1993）。

mtDNA的基因结构比较简单、稳定，分子量小（15.7～19.5kb），处于限制性内切酶分析范围，因此易于进行结果分析（Brown 1979）。

在脊椎动物中，mtDNA无组织特异性，即个体内的线粒体DNA具有高度的均一性（Avise等 1983），这就有利于限制性内切酶分析。

更为重要的是，mtDNA进化速度快，是单拷贝核DNA的5～10倍，因而是进行近缘种间和种内群体间分化关系研究的良好遗传标记（Brown等 1979，1983；Wilson 1985；Avise 1986；Harrison 1989）。

生物多样性研究中基本保护单元----进化显著性单元（evolutionary significant units，简称ESUs）（Ryder 1989）的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体DNA单倍型的系统发育关系（Moritz 1994）。

ESUs的定义为：在mtDNA单倍型上互为单系群（monophyly）、在核基因座位上等位基因频率有显著差别的群体即称为ESUs。

强调mtDNA的互为单系群，不仅因为它在进化上的重要性，而且因为理论上和模拟实验均说明隔离群体在一定时间后能达到这种状态。

如何用PCR法检测基因的多态性多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。

在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。

这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。

基因多态性的主要检测方法简述如下：1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，钠问亢兔扛銎蔚某ざ染筒煌此降南拗菩云纬ざ榷嗵裕贾孪拗破纬ざ确⑸谋涞拿盖形坏悖殖莆嗵晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。

现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。

相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。

在电泳时泳动的速度不同。

将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。

在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。

其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。

突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。

RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。

下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。

RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。

它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。

RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。

2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。

限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。

如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。

3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。

4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。

RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。

通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。

2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。

通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。

3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。

4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一根本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。

碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。

用特定的限制性内切酶消化目的DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。

三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。

对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中别离获取，并制备足够的量。

为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目的片段。

无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。

(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目的DAN，选择适宜的限制性内切酶。

目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。

该步骤必须保证酶解完全。

假如有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。

酶解的时间根据实际情况而定。

(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)别分开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。

电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

时间由几小时到24小时不等。

(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。

常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。

转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。

转印的方法一般有三种。

根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。

1 盐桥法；也叫毛细管转移法。

先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上枯燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。

实验六、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。

二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。

三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。

四、实验步骤1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：10xM buffer 1 μLddH2O 5.5 μLHind Ⅲ0.5 μLPCR产物 3 μL37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。

2、琼脂糖凝胶电泳11 配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。

DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。

待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。

五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。

（画图）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTTTTCGA ↑AABAA BB 2000 750 5002501000100。

现有分子标记有哪些（类型，优缺点和应用）？。

现有的分子标记有：1、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：优点：数量不受限制。

缺点：但克隆可探针较为困难、操作较繁锁、周期长、费用高。

2、数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）：优点：小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。

缺点：数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。

VNTR 也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。

3、随机引物的PCR标记①随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)，优点：⑴简单，速度快；⑵ RAPD分析只需少量DNA样品；⑶不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；⑷成本较低。

缺点：⑴RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；⑵存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；⑶RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

②任意引物PCR(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR)优点：AP-PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。

在杂合体中仅可辨别长度多态性缺点：每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。

③DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)优点：提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10-100个DNA片段。

缺点：PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染可产生非常复杂带型。