致鹅败血症粪肠球菌的分离鉴定

2018年第9期 吉林畜牧兽医5·实验研究·ShiYan YanJiu长春及周边地区鹅致病性大肠杆菌的分离鉴定及敏感药物筛选姚佳鑫，许祺珺，刘嘉怡，张国强，薛晶晶，赵立峰*吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118摘 要：为了给长春及周边地区鹅大肠杆菌病提供可行用药方案，本研究采集230份疑似大肠杆菌病患鹅的心、肝、脾等组织，进行病原学检测。

经过分离培养、纯培养、显微镜镜检、生化试验及分子生物学试验，其中190份被鉴定为大肠杆菌。

选用52种临床常用抗菌药物进行体外药敏试验，药敏试验结果表明：分离菌株对庆大霉素、阿莫西林、盐酸土霉素、诺氟沙星产生耐药性，对硫酸粘菌素、阿米卡星、磷霉素钠和氧氟沙星高度敏感。

关键词：鹅；大肠杆菌病；药敏试验鹅大肠杆菌病（goose E.colidisease,GED）是由致病性大肠杆菌引起的局部或全身性感染的细菌性疾病，各种年龄的鹅均可感染，感染率5%～30%不等，病死率在90%以上[1]。

临床上以脐炎、眼结膜炎、气囊炎、心包炎和败血症等为主要特征。

为了预防细菌性传染病，许多鹅场长期投喂抗生素药物，致使致病菌产生耐药性。

因此，有必要对病鹅进行药敏试验以确定敏感药物，进行合理的投药，使大肠杆菌病用药更有针对性。

本研究从长春及周边地区鹅场共收集230份病料，共分离得到190例致病性大肠杆菌样本，其中长春32例、双阳32例、松原30例、舒兰20例、白城18例、德惠12例、公主岭10例、农安10例、辽源8例、吉林6例、四平6例、龙昭6例。

对分离获得的菌株进行了敏感药物筛选，具体过程如下。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料来源于松原、通化、白城、舒兰、双阳、农安等多个地区的多家养殖场的疑似大肠杆菌病患鹅。

患鹅临床主要表现为食欲减退，精神沉郁，生长停滞，消瘦，拉白色稀粪。

鹅眼睑肿胀流泪，眼圈周围的羽毛被浸湿，瞳孔逐渐出现白色浑浊，角膜浑浊，眼球时有萎缩、坏死、失明。

健康婴儿粪便中粪肠球菌的分离鉴定与体外安全性评价桑微1，李国花1，赵馨1，马雨哲1，钱卫生2，鲁曦1*（1.陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西西安710021）（2.空军军医大学唐都医院室，陕西西安710038）摘要：为筛选出符合安全要求的粪肠球菌，该研究以采集的1月龄健康婴儿粪便样本为研究对象，采用MRS 分离纯化和16S rRNA测序进行菌种鉴定，共鉴定出64株粪肠球菌。

该研究对其中16株菌进行体外安全性评价，分别考察其溶血性、抗生素敏感性和6种毒力基因。

结果发现16株粪肠球菌均未出现β溶血现象；药敏试验发现菌株对四环素（56.25%）、红霉素（43.75%）耐药率较高，青霉素（37.50%）和环丙沙星（31.25%）次之，未发现万古霉素和替考拉宁耐受菌株；继上述实验获得的8株相对安全菌株进行毒力基因检测，共检出5种毒力基因：ace、asal、efaA、cylA、gelE，以ace＋efaA＋gelE＋为主要携带模式；综合评价后最终得到4株粪肠球菌候选菌株，编号为：LX29、LX31、LX41、LX50，可为后续的功能性研究和产品开发奠定基础。

关键词：粪肠球菌；抗生素耐药性；毒力基因文章编号：1673-9078(2024)03-83-90 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.3.0273Isolation, Identification, and in Vitro Safety Evaluation of Enterococcusfaecalis in the Stool of Healthy InfantsSANG Wei 1, LI Guohua1, ZHAO Xin1, MA Yuzhe1, QIAN Weisheng2, LU Xi1*(1.School of Food Science and Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi’an 710021, China)(2.Tangdu Hospital, Air Force Medical University, Xi’an 710038, China)Abstract: To screen for safe strains of Enterococcus faecalis, stool samples were collected from healthy 1-month-old infants and strains were cultured in MRS medium. A total of 64 E. faecalis strains were identified via 16S rRNA sequencing.Among them, 16 were selected for in vitro safety evaluation, and their hemolytic property, antibiotic sensitivity, and six virulence genes were determined. Based on the hemolysis results, the 16 strains of E. faecalis did not exhibit β-hemolysis.Further, the antibiotic sensitivity tests revealed that the strains were highly resistant to tetracycline (56.25%) and erythromycin(43.75%), followed by penicillin (37.50%) and ciprofloxacin (31.25%). No vancomycin- and teicoplanin-resistant strainswere found. Eight relatively safe strains were identified based on the above experiments, and five virulence genes: ace, asal, efaA, cylA, and gelE, were subsequently determined, with ace+efaA+gelE+ as the dominant mode. Finally, four candidate引文格式：桑微,李国花,赵馨,等.健康婴儿粪便中粪肠球菌的分离鉴定与体外安全性评价[J] .现代食品科技,2024,40(3):83-90.SANG Wei, LI Guohua, ZHAO Xin, et al. Isolation, identification, and in vitro safety evaluation of Enterococcus faecalis in the stool of healthy infants [J] . Modern Food Science and Technology, 2024, 40(3): 83-90.收稿日期：2023-03-07基金项目：国家自然科学基金项目（31970115）；陕西省重点研发计划（2022NY-030）作者简介：桑微（1999-），女，硕士研究生，研究方向：益生菌基础与应用，E-mail：通讯作者：鲁曦（1983-），男，博士，副教授，研究方向：益生菌资源开发与利用，E-mail：83strains of E. faecalis, namely LX29, LX31, LX41, and LX50, were acquired after comprehensive evaluation. Overall, our findings lay the foundation for subsequent functional research and product development.Key words:Enterococcus faecalis; antibiotic resistance; virulence gene肠球菌是广泛存在于自然界的一类乳酸菌，具有高pH和高盐耐受性，参与营养物质代谢，能产生细菌素抑制病原体生长，在食品发酵、防腐以及动物饲料等领域发挥重要作用[1] ；同时作为定殖于消化道的共生菌，具有调节人体和动物的免疫系统、维持肠道内稳态等功能，已被推荐作为益生菌食品添加剂和治疗肠道菌群失调及其它疾病的备选菌种[2] 。

牛源粪肠球菌的分离鉴定及药敏试验作者：彬彬郭继文来源：《农民致富之友》2010年第20期肠球菌属(Enterococcus)细菌为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，是人、犬、禽、猪、马等动物胃肠道正常菌群之一，也广泛分布于土壤、水和食物中。

长期以来被认为致病力较低而未引起重视，但近年来，肠球菌属条件致病菌所致感染的发生率持续升高，尤其在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。

１材料与方法１.1材料１.1.1粪样选自黑龙江垦区某农场的40头健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鲜粪便作为试验材料。

１.1.2培养基血平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、葡萄糖肉汤、营养肉汤、生化鉴定管等均购自广东环凯生物科技有限公司。

１.1.3试验动物18～26 g健康的小白鼠。

１.2方法１.2.1粪样的采集肛门式采集。

用无菌橡胶手套直接从试验牛的肛门采集新鲜粪样，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中，立即送实验室4 ℃保存备用。

１.2.2细菌的分离鉴定１.2.2.1细菌的分离纯化培养将新鲜粪样接种于葡萄糖肉汤中，置37℃，18～24h，进行增菌培养。

再将肉汤培养物接种到KF链球菌琼脂上，置37℃，培养24h。

将可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。

并接种于胰蛋白胨大豆琼脂、营养琼脂、血平板、麦康凯琼脂和葡萄糖肉汤、营养肉汤培养基中，置37℃培养18～24h，观察菌落生长状况。

观察细菌生长状况以及菌落形态特征，并将其进一步纯化培养。

将所得纯培养物置胰蛋白胨大豆琼脂斜面保存备用。

１.2.2.2触酶试验从固体培养基上挑取1接种环待检菌,置于洁净玻片上，再滴加3%过氧化氢一大滴，立即观察结果。

在30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

１.2.2.3溶血试验用平板法测定分离菌的溶血特性，即取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察菌落周围溶血现象。

致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析狄婷婷;高原;聂鑫【摘要】To understand the genetic variation of cytolysin activator(CylA) gene in Enterococcus faecalis , 2 pairs of specific primers were designed and synthesized according to the CylA gene sequence from GenBank for the 4 clinical isolates causing goose septicemia. The CylA gene was cloned into pMD18-T vector, and the recomfainant plasmid was screened to sequence and compared with the CylA genes of 4 pathogenic Enterococcus faecalis from patients in foreign countries and pigs in China respectively. The homology was alignmented and phylogenetic tree was reconstructed with Lasergene 7. 0. Result showed that CylA genes of 4 strains from goose were average 1 239bp in average, where was a completed open reading frame encoding 412 amino acids. No deletion and insertion in sequences, while only one nonsense mutation did not cause the variation of amino acid. There was not much variation in the remaining 8 strains of CylA gene and the deduced amino acids. The amino acids deduced by these CylA genes of 4 strains from goose shared 100 % homology. They were also close to the amino acids deduced by CylA genes of bacteria from patients in foreign countries and pigs in China, sharing the homologies of 98. 6% to 100%. These results indicate that CylA gene in Enterococcus faecalis is highly conserved, which is likely to become the target genes of detection and diagnosis as well as immunoprophylaxis.%目的了解粪肠球菌溶血素激活因子(CylA)基因的遗传变异情况.方法根据GenBank上已发表的粪肠球菌CylA基因序列设计2对特异性引物,对临床分离的4株致鹅败血症粪肠球菌CylA基因进行克隆及序列测定,并与国外从人体分离的和国内从猪体分离的各4株致病性粪肠球菌的CylA基因,用LaSergene 7.0软件进行同源性比对和构建系统进化发育树.结果鹅源4株茵CylA基因均长1 239bp,有1个完整的开放阅读框,编码412个氨基酸；序列中无缺失和插入,仅有l处未引起其编码氨基酸变异的无义突变.其余8株菌CylA基因及推导的氨基酸变异程度均不大.4株鹅源菌CylA基因推导的氨基酸同源性为100％；与国外人源菌和国内猪源菌CylA基因推导的氨基酸遗传距离也较近,同源性为98.6％～100％.结论粪肠球菌CylA基因高度保守,有可能成为检测诊断和免疫预防的靶基因.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】6页(P683-688)【关键词】鹅;粪肠球菌;溶血素激活因子;克隆;同源性比对;系统进化发育树【作者】狄婷婷;高原;聂鑫【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042【正文语种】中文【中图分类】R378肠球菌引起医院内病人感染和死亡的例数正在逐步增加［1］，其致病菌主要是粪肠球菌［2－3］。

1例种鹅大肠杆菌病病原的分离与鉴定作者：刘明生甘辉群袁橙郝福星康金龙周国栋来源：《安徽农业科学》2018年第31期摘要从江苏兴化市某种鹅场有疑似大肠杆菌病的病死鹅中，通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、血清型鉴定，分离鉴定出鹅大肠杆菌，其血清型为O11；通过动物致病性试验，该菌株致病性中等毒力；药敏试验结果表明，所分离的大肠杆菌对氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星高度敏感，这为临床防治鹅大肠杆菌病提供实验依据，并为制备鹅大肠杆菌自家苗奠定基础。

关键词种鹅；大肠杆菌；分离鉴定；血清型；药敏试验中图分类号 S858.33文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0069-02Abstract The Escherichia coli was isolated and identified from a goose farm in Xinghua City，Jiangsu Province， by bacteria isolation and culture， morphological observation， biochemical test， serotype identification， and the serotype of E.coli was O11.The pathogenicity of the strain was moderately virulent by animal pathogenicity test.The results of drug sensitivity test showed that the isolated E.coli was highly sensitive to flumequine， colistin sulphate， gentamicin and amikacin， which provided the experimental basis for clinical prevention and treatment of goose E.coli and laid a foundation for the preparation of goose E.coli vaccine.Key words Breeding geese；Escherichia coli；Separation and identification；Serotype；Drug sensitive test鹅大肠杆菌病为危害养鹅业的主要传染病之一，是由致病性埃希大肠杆菌所引起的，临床表现为心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎以及脑炎等，成年种鹅感染本病，可引起输卵管炎、卵黄性腹膜炎，俗称“蛋子瘟”，导致种鹅繁殖机能降低，甚至引发死亡，给种鹅养殖户带来较大的经济损失。

成鹅大肠杆菌病原的分离与鉴定摘要：目的对一群疑似大肠杆菌病的成年鹅进行病原的分离与鉴定，为该病的防治提供依据。

方法挑取疑似死于大肠杆菌病成年鹅的心血、肝脏，接种于麦康凯琼脂培养基，37℃下培养24h，制备抹片、革兰氏染色镜检、生化试验及药敏试验。

结果在上述试验中分离到1株革兰氏阴性小杆菌，该菌的生化试验结果与大肠杆菌一致。

选择药敏试验中敏感的药物环丙沙星给病成鹅注射，连用3天，得到了有效治疗，病鹅逐步恢复健康。

结论该群病死鹅的发病原因为致病性大肠杆菌感染。

【关键词】：^p ：大肠杆菌；分离；鉴定；生化试验；药敏试验20________年12月，安徽休宁某养殖户饲养的1000只140日龄成鹅相继出现精神沉郁、采食量下降、排白色稀粪、消瘦等症状，发病几天后出现死亡。

剖检病死鹅，观察到心包膜增厚，心包内充满大量淡黄色液体，肝脏表面覆盖有浅黄色的纤维性渗出物，肠道出血。

本试验主要是为了查明该群鹅的发病原因，特对其进行细菌的分离鉴定，并通过药敏试验确定敏感药物，为该群病鹅的防治提供依据。

一、材料与方法1.材料（1）病料来。

安徽休宁某养殖户送检的疑似感染大肠杆菌病死成年鹅3只。

（2）培养基。

蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖半固体发酵管，蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水，麦康凯琼脂培养基，营养琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基。

2.方法（1）细菌的分离培养。

无菌采取病死鹅的心血、肝脏，用接种环划线接种于麦康凯琼脂培养基中，37℃下培养24h。

然后挑取单个红色的典型菌落接种到伊红美蓝琼脂平板上，37℃培养24h，进行革兰氏染色镜检，最后从伊红美蓝琼脂平板上挑取紫黑色带金属光泽的单个典型菌落，接种到营养琼脂平板上，37℃培养24 h，获得纯培养物，置4℃冰箱备用。

（2）细菌抹片制备及革兰氏染色镜检。

从麦康凯琼脂培养基上挑取单个粉红色的菌落，制备抹片、革兰氏染色镜检。

（3）细菌的生化试验。

主要进行了糖类分解试验、吲哚试验、甲基红4816001.gif" style="ma____-width:450p____" width="450p____" alt="成鹅大肠杆菌病原的分离与鉴定" title="成鹅大肠杆菌病原的分离与鉴定"/> （MR）试验及VP试验（4）细菌药物敏感试验。

中国畜牧兽医 2022,49(7):2778-2787C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e ri n a r y Me d i c i n e 鹅粪便中特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌的分离鉴定魏 笑,王秋菊,孙 愉,张 昊,李畅洋,陶燕子(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆163319)摘 要:ʌ目的ɔ从鹅粪中分离芽孢杆菌属和乳杆菌属细菌,为鹅源功能菌研究和合理用药提供参考㊂ʌ方法ɔ收集30只50周龄健康北方白鹅的直肠粪便,利用特异性培养基和生化反应试验分离筛选菌株,筛选的菌株通过D N A提取㊁P C R 扩增16S r D N A 测序鉴定后,与G e n B a n k 中参考菌株进行比对构建进化树,进行相似性比对确定菌株种类㊂培养48h 后检测细菌的生长特性㊁最适酸碱度和温度,以p H7.0㊁无胆盐环境下细菌生长状态为对照,检测其耐酸耐胆盐能力,并进行药敏试验检测其对抗菌药的耐受性㊂ʌ结果ɔ经分离筛选共获得9株细菌,通过生化试验最终选出2株菌,根据进化树的进化距离和相似性比对确定其分别是特基拉芽孢杆菌C C 2F G 2和类肠膜魏斯氏菌J Y 0R 2㊂生长特性结果显示,特基拉芽孢杆菌C C 2F G 2在培养基p H 为6.5㊁温度为30ħ条件下培养16h 的增殖效果最好,可以耐受1.2%胆盐,活菌数是无胆盐的69.2%,耐酸特性比较强,培养基p H 为3.5的强酸环境下活菌数是p H 为7.0的81.5%;抗菌药耐受性结果显示,其对氧氟沙星㊁诺氟沙星㊁卡那霉素㊁链霉素㊁克拉霉素㊁红霉素㊁复方新诺明和万古霉素敏感,对头孢呋辛,头孢唑林㊁头孢噻肟㊁氨苄西林㊁呋喃妥因㊁环丙沙星㊁庆大霉素和四环素不敏感㊂类肠膜魏斯氏菌J Y 0R 2在培养基p H 为6.0㊁温度为36.5ħ的环境中培养18h 增殖效果最好,在1.2%胆盐下活菌数是无胆盐的50.6%,在p H 为3.5的强酸环境下活菌数是p H 为7.0的87.6%,对环丙沙星㊁氧氟沙星㊁诺氟沙星㊁克拉霉素和红霉素敏感,对卡那霉素㊁呋喃妥因和四环素中度敏感,对头孢呋辛㊁头孢唑林㊁头孢噻肟㊁氨苄西林㊁复方新诺明㊁万古霉素㊁庆大霉素和链霉素不敏感㊂ʌ结论ɔ鹅源特基拉芽孢杆菌C C 2F G 2和类肠膜魏斯氏菌J Y 0R 2具有很好的耐酸㊁耐胆盐特性,且特基拉芽孢杆菌可以与部分β-内酰胺类㊁喹诺酮类㊁氨基糖苷类㊁硝基呋喃类和四环素类抗菌药联合使用,类肠膜魏斯氏菌可以与部分β-内酰胺类和氨基糖苷类抗菌药联合使用㊂该结果可为鹅源功能菌的研发提供参考㊂关键词:特基拉芽孢杆菌;类肠膜魏斯氏菌;生长特性;酸碱耐受性中图分类号:S 835文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.036 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-07基金项目:2021年黑龙江省畜牧技术推广项目(N Y 202102);2019年黑龙江省科技成果转化基地与推广项目(J Y 201901);大庆市新能源领域 揭榜挂帅 科技攻关项目(2021B D 05)联系方式:魏笑,E -m a i l :v x i a o 0901@163.c o m ㊂通信作者王秋菊,E -m a i l :w q j_9@163.c o m I s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f B a c i l l u s t e qu i l e n s i s a n d W e i s s e l l a p a r a m e s e n t e r o i d e s f r o m G o o s eF e c e sW E IX i a o ,WA N G Q i u j u ,S U N Y u ,Z H A N G H a o ,L IC h a n g y a n g,T A O Y a n z i (C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e i l o n g j i a n g B a yi A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,D a q i n g 163319,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e a i mo f t h i s s t u d y wa s t o i s o l a t e B a c i l l u s a n d L a c t ob ac i l l u s f r o m g o o s e f e c e s ,s oa s t o p r o v id eref e r e n c e s f o r t h es t u d y o fg o o s e -d e r i v e df u n c t i o n a lb a c t e r i aa n dr a t i o n a l d r u g u s e .ʌM e th o d ɔT h er e c t a lf e c e so f3050-w e e k -o l d h e a l t h y No r t h e r n W h i t e g e e s e w e r e c o l l e c t e d ,a n d t h e s t r a i n sw e r e i s o l a t e da n ds c r e e n e db y s pe c if i c c u l t u r em e d i u ma n db i o c h e m i c a l7期魏笑等:鹅粪便中特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌的分离鉴定r e a c t i o nt e s t.T h es e l e c t e ds t r a i n s w e r ei d e n t i f i e d b y D N A e x t r a c t i o na n d P C R a m p l i f i c a t i o n 16S r D N As e q u e n c i n g.T h e p h y l o g e n e t i ct r e e w a se s t a b l i s h e db y c o m p a r i n g w i t ht h er e f e r e n c e s t r a i n s i nG e n B a n k a n d t h e s t r a i n sw e r e i d e n t i f i e d b y h o m o l o g y c o m p a r i s o n.A f t e r48h o f c u l t u r e, t h e g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s,o p t i m u m p H a n dt e m p e r a t u r eo fb a c t e r i aw e r ed e t e c t e d.T h e g r o w t h s t a t u s o f b a c t e r i au n d e r p H7.0a n dn ob i l e s a l t e n v i r o n m e n tw a su s e da s c o n t r o l.T h e a b i l i t y o f a c i d a n db i l es a l t t o l e r a n c ew a sd e t e c t e d,a n dt h et o l e r a n c eo fa n t i b i o t i c sw a sd e t e c t e db y d r u g s e n s i t i v i t y t e s t.ʌR e s u l tɔA f t e r i s o l a t i o na n ds c r e e n i n g,9s t r a i n so f b a c t e r i aw e r eo b t a i n e d,a n d2 s t r a i n sw e r ef i n a l l y s e l e c t e d b y b i o c h e m i c a lt e s t.A c c o r d i n g t ot h ee v o l u t i o n a r y d i s t a n c ea n d h o m o l o g y c o m p a r i s o n o ft h e p h y l o g e n e t i ct r e e,t h e y w e r e B a c i l l u st e q u i l e n s i s C C2F G2a n d W e i s s e l l a p a r a m e s e n t e r o i d e s J Y0R2.T h er e s u l t so f g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c ss h o w e dt h a t B a c i l l u s t e q u i l e n s i s C C2F G2h a d t h eb e s t p r o l i f e r a t i o ne f f e c tu n d e r t h ec o n d i t i o no fm e d i u m p H6.5a n d t e m p e r a t u r e30ħf o r16h,w h i c h c o u l d t o l e r a t e1.2%b i l e s a l t,t h e n u m b e r o f v i a b l e b a c t e r i aw a s 69.2%o f t h a tw i t h o u t b i l e s a l t,a n d t h e a c i d r e s i s t a n c ew a s s t r o n g.T h e n u m b e r o f v i a b l e b a c t e r i a u n d e r t h e s t r o n g a c i d e n v i r o n m e n t o fm e d i u m p H3.5w a s81.5%o f t h a t o f p H7.0.T h e r e s u l t s o fa n t i b i o t i c t o l e r a n c e s h o w e d t h a ti t w a s s e n s i t i v e t o o f l o x a c i n,n o r f l o x a c i n,k a n a m y c i n, s t r e p t o m y c i n,c l a r i t h r o m y c i n,e r y t h r o m y c i n,c o m p o u n ds u l f a m e t h o x a z o l e a n dv a n c o m y c i n,b u tn o t s e n s i t i v e t oc e f u r o x i m e,c e f a z o l i n,c e f o t a x i m e,a m p i c i l l i n,n i t r o f u r a n t o i n,c i p r o f l o x a c i n,g e n t a m i c i n a n d t e t r a c y c l i n e.I n t h e m e d i u m w i t h p H o f6.0a n d t e m p e r a t u r e o f36.5ħ,W e i s s e l l a p a r a m e s e n t e r o i d e s J Y0R2h a d t h eb e s t p r o l i f e r v a t i o ne f f e c tw h e nc u l t u r e d f o r18h.U n d e r1.2% b i l e s a l t,t h en u m b e ro fv i a b l eb a c t e r i aw a s50.6%o f t h a tw i t h o u tb i l es a l t.U n d e rs t r o n g a c i d e n v i r o n m e n tw i t h p H3.5,t h en u m b e r o f v i a b l eb a c t e r i aw a s87.6%o f t h a tw i t h p H7.0.I tw a s s e n s i t i v et oc i p r o f l o x a c i n,o f l o x a c i n,n o r f l o x a c i n,c l a r i t h r o m y c i n a n d e r y t h r o m y c i n,m o d e r a t e l y s e n s i t i v e t ok a n a m y c i n,n i t r o f u r a n t o i na n dt e t r a c y c l i n e,a n di n s e n s i t i v et oc e f u r o x i m e,c e f a z o l i n, c e f o t a x i m e,a m p i c i l l i n,c o m p o u n ds u l f a m e t h o x a z o l e,v a n c o m y c i n,g e n t a m i c i n a n ds t r e p t o m y c i n.ʌC o n c l u s i o nɔT h er e s u l t so ft h ea b o v es t u d i e ss h o w e dt h a t B a c i l l u s t e q u i l e n s i s C C2F G2a n d W e i s s e l l a p a r a m e s e n t e r o i d e s J Y0R2i s o l a t e df r o m g e e s eh a d g o o da c i dr e s i s t a n c ea n db i l es a l t r e s i s t a n c e,a n d B a c i l l u s t e q u i l e n s i s c o u l db e u s e d i n c o m b i n a t i o nw i t h s o m eβ-l a c t a m s,q u i n o l o n e s, a m i n o g l y c o s i d e s,n i t r o f u r a n s a n d t e t r a c y c l i n e s,a n d W e i s s e r i a p a r a m e s e n t e r o i d e s c o u l db eu s e d i n c o m b i n a t i o nw i t hs o m eβ-l a c t a m s a n d a m i n o g l y c o s i d e s,p r o v i d i n g a r e f e r e n c e f o r t h ed e v e l o p m e n t o f g o o s e-d e r i v e d f u n c t i o n a l b a c t e r i a.K e y w o r d s:B a c i l l u st e q u i l e n s i s;W e i s s e l l a p a r a m e s e n t e r o i d e s;g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s;a c i d-a l k a l i t o l e r a n c e微生物制剂具有维持肠道菌群平衡,分泌益生物质提高动物免疫力,改善食物消化和吸收,诱导免疫反应等优点,为抗菌药替代物的研发提供了依据和保障,逐渐被人们接受并广泛应用在养殖业上,以达到预防疾病㊁促进畜牧业健康发展的目的,因此需要进一步了解其最佳的生长环境及主要的功能㊂特基拉芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性杆菌,严格好氧㊂芽孢杆菌属产生的芽孢对植物病原体具有抑制能力,研究表明特基拉芽孢杆菌抑菌谱广,具有较高的生防能力,是天然的抗菌活性物质[1],尤其对植物的土传病害 青枯病有良好的防治效果㊂周瑚等[2]研究发现,特基拉芽孢杆菌有稳定的抑菌作用,对高温㊁紫外线和酸碱环境有较强抵抗性, O b e r o i等[3]报道,抗菌蛋白的温度和酸碱度稳定性对其产品的研发应用起关键作用,可用特基拉芽孢杆菌制成农药㊂孙龙龙[4]研究发现,特基拉芽孢杆菌可以提高鲫的消化能力㊁抗氧化能力和免疫力,并增加鲫肠道菌群中有益菌的丰度,降低有害菌的丰度㊂因此特基拉芽孢杆菌具有较强的抗菌㊁助消化及改善肠道菌群丰度的功能,可以进一步作为功能菌开发利用㊂魏斯氏菌是一种存在于发酵产品中的革兰氏阳性乳酸菌,不运动不产生孢子,兼性厌氧,9772中国畜牧兽医49卷呈不规则的短杆状㊂研究表明,类肠膜魏斯氏菌产酸能力高,对大肠杆菌㊁金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有良好的抑制作用[5]㊂刘韶娜[6]研究表明,类肠膜魏斯氏菌能够降低猪粪便中的粗蛋白和铵态氮,降低猪的腹泻率和便秘率,能够提高肠道内的脂肪酸含量并促进脂类代谢和维生素合成㊂由此可见类肠膜魏斯氏菌可作为猪饲料添加剂应用,但在禽上的应用还鲜见报道㊂本试验拟从鹅肠道中分离芽孢杆菌属和乳杆菌属细菌,检测其最佳生长时间㊁p H和温度及其对酸碱度㊁胆盐和抗菌药的耐受性,旨在为后续作为功能菌开发提供参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1样品选取黑龙江省某畜牧场50周龄左右健康的体重为(6.7ʃ1.2)k g的大群散养北方白鹅种鹅30只,在采食30m i n后,取粪盒悬挂于鹅的泄殖腔外收集新鲜直肠粪便㊂将收集的粪便放入装有冰袋的保温盒中带回实验室㊂1.1.2主要试剂甘露醇卵黄多黏菌素培养基(H B0248)㊁M R S培养基(H B0109)㊁L B肉汤培养基(H B0128)㊁M u e l l e r-H i n t o n琼脂(H B6232)均购自青岛海博生物科技有限公司;醋酸铅培养基(L8490)购自北京索莱宝科技有限公司;羧甲基纤维素钠培养基购自山东拓普生物工程有限公司㊂抗菌药庆大霉素㊁卡那霉素㊁链霉素㊁四环素㊁头孢呋辛㊁头孢唑啉㊁头孢噻肟㊁氨苄西林㊁克拉霉素㊁红霉素㊁复方新诺明㊁呋喃妥因㊁氧氟沙星㊁诺氟沙星㊁环丙沙星㊁万古霉素均购自杭州滨河微生物试剂有限公司㊂1.1.3培养基配制 ①硝酸盐还原培养基:100m L 蒸馏水中加入1.00g琥珀酸钠㊁0.10g硝酸钠㊁0.10g磷酸二氢钾㊁0.05g七水硝酸镁㊁0.02g氯化钾㊂②淀粉培养基:100m L蒸馏水中加入2.00g 可溶性淀粉㊁0.50g蛋白胨㊁0.50g氯化钠㊁2.00g 琼脂,p H7.0㊂③酪素培养基:100m L蒸馏水中加入1.00g干酪素㊁0.10g酵母膏㊁2.00g琼脂㊂④酸性汞指示剂:100m L蒸馏水中加入15.00g氯化汞㊁20m L浓盐酸㊂配制后,121ħ高压灭菌15m i n后倒入培养皿中待用㊂1.2方法1.2.1细菌的分离按1g/只分别称取30只鹅的粪便,各加入9m L生理盐水振荡混匀,取100μL 混合液加900μL生理盐水进行倍比稀释,取稀释到10-6㊁10-7㊁10-8的菌液各100μL加入到已配好的M R S固体培养基中,用涂布棒涂抹均匀,37ħ恒温培养箱中培养48h㊂用接种环挑取单一菌落重新划线培养,重复3~4次㊂1.2.2细菌筛选及生化鉴定通特异性培养基和革兰氏染色对所得菌株进行形态上的初步筛选,保留形态明显的菌株㊂将初筛的细菌纯化后分别接种至L B肉汤中培养,再通过硝酸盐还原㊁产淀粉酶㊁产硫化氢㊁产纤维素酶㊁产蛋白酶和接触酶试验等生化反应进一步筛选㊂1.2.316Sr D N A鉴定采用煮沸法提取细菌D N A㊂利用细菌16Sr D N A基因通用引物343F: 5'-T A C G G R A G G C A G C A G-3'和798R:5'-A G G G-T A T C T A A T C C T-3'[7]进行P C R扩增㊂P C R反应体系25μL:2ˑP r e m i x T a q12.5μL,上㊁下游引物各1μL,D N A2μL,d d H2O8.5μL㊂P C R反应条件:94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,64ħ退火30s,72ħ延伸30s,共30个循环;72ħ终延伸10m i n;4ħ保存㊂将得到的P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,检测D N A的大小及浓度,并P C R 扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行16Sr D N A测序㊂最后获得的D N A部分序列与G e n B a n k中参考菌株特基拉牙孢杆菌(B a c i l l u s t e q u i l e n s i s)㊁枯草牙孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i t i s)等序列进行比对,用M e g a11.0构建进化树,用M e g A l i g n进行相似性比对㊂1.2.4生长曲线绘制取100μL筛选出的分离菌菌液按2.0%接种量分别接种到5m LL B液体培养基中,以未接种细菌的L B液体培养基为对照, 37ħ㊁150r/m i n摇床中培养,分别在0㊁2㊁4㊁6㊁8㊁10㊁12㊁14㊁16㊁18㊁20㊁22㊁24㊁36㊁48h时取培养液测量D600n m值,以时间为横坐标㊁D600n m值为纵坐标绘制生长曲线㊂1.2.5 细菌培养基酸碱度测定用H C l和N a O H将L B液体培养基p H调至6.0㊁6.5㊁7.0㊁7.5㊁8.0,取100μL筛选出的分离菌菌液按2.0%接种量接种,以未接种菌液的L B液体培养基为空白对照,37ħ㊁150r/m i n摇床中培养24h,测量D600n m值㊂1.2.6细菌适宜培养温度测定取100μL筛选出的分离菌菌液分别接种到5m LL B液体培养中,分别将温度调至36.0㊁36.5㊁37.0㊁37.5和38ħ,以未接种菌液的L B培养基作为空白对照,培养24h 后测量D600n m值㊂08727期魏 笑等:鹅粪便中特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌的分离鉴定1.2.7 酸性和高胆盐浓度环境下细菌存活率测定 取筛选出的分离菌菌液接至p H=7.0的L B 液体培养基中作为耐酸试验的空白对照,将菌液接至无胆盐的L B 液体培养基中为耐胆盐试验的空白对照,分别将菌液接至p H 为2.0㊁2.5㊁3.0㊁3.5㊁4.0及胆盐浓度为0.3%㊁0.6%㊁0.9%㊁1.2%㊁1.5%㊁1.8%的培养基中,37ħ㊁150r /m i n 摇床中培养24h ,测定D 600n m 值㊂酸性环境下细菌存活率(%)=各p H 组D 600n m 值/未经酸处理组D 600n m值ˑ100%;高胆盐浓度环境下细菌存活率(%)=各胆盐浓度组D 600n m 值/无胆盐组D 600n m 值ˑ100%㊂1.2.8 抗菌药耐受性测定 取100μL 筛选出的分离菌菌液,活菌数>1ˑ109C F U /m L ,分别涂布到MH 培养基中,用涂布棒涂抹均匀,放置抗菌药药片,轻轻压实,置恒温培养箱内培养24h ,并用直尺测量抑菌圈直径,以美国S C L A 抗微生物敏感性试验执行标准M 100做比较以判定菌株药物敏感性(表1)㊂表1 药物敏感性判断标准T a b l e 1 J u d g e m e n t s t a n d a r d f o r d r u g s e n s i t i v i t y 抗菌药A n t i b i o t i c s 纸片含药量C o n t e n t /(μg /片)判断标准J u d g e m e n t s t a n d a r d /m m SIR头孢呋辛C e f u r o x i m e 30ȡ1815~17ɤ14头孢唑啉C e f a z o l i n30ȡ2320~22ɤ19头孢噻肟C e f o t a x i m e s o d i u m 30ȡ2623~25ɤ22氨苄西林A m p i c i l l i n 10ȡ1714~16ɤ13呋喃妥因F u r a n t o i n300ȡ1715~16ɤ14复方新诺明P a e d i a t r i c c o m po u n d s u l f a m e t h o x a z o l e t a b l e t s 23.75μg S M Z /1.25μg TM Pȡ1611~15ɤ10氧氟沙星O f l o x a c i n 5ȡ1613~15ɤ12诺氟沙星N o r f l o x a c i n10ȡ1613~15ɤ12环丙沙星C i p r o f l o x a c i n 5ȡ2116~20ɤ15万古霉素V a n c o m y c i n 30ȡ1715~16ɤ14链霉素S t r e p t o m y c i n 10ȡ1512~14ɤ11庆大霉素G e n t a m i c i n 10ʃ2.5ȡ1513~14ɤ12克拉霉素K l a r i c i d 15ȡ1814~17ɤ13卡那霉素K a n a m y c i n 30ȡ1814~17ɤ13红霉素E r y t h r o m yc i n 15ȡ1814~17ɤ13四环素T e t r a c yc l i n e 30ȡ1512~14ɤ11S ,敏感;I ,中介;R ,耐药㊂表5同S ,S e n s i t i v e ;I ,I n t e r m e d i a r y;R ,R e s i s t a n t .T h e s a m e a s t a b l e 52 结 果2.1 细菌的分离及生化鉴定利用M R S 培养基分离乳酸菌,在培养基上形成表面光滑的乳白色菌落,革兰氏染色呈长杆状㊁产芽孢的菌体,为革兰氏阳性菌(图1A );芽孢杆菌使甘露醇卵黄多黏菌素培养基变色,在表面形成不透明的白色菌落,革兰氏染色呈短杆状㊁单个或链状排列的菌体,为革兰氏阳性菌(图1B )㊂从30只鹅中共获得9株菌,3株为乳酸菌(编号1~3),6株为芽孢杆菌(编号4~9)㊂由表2生化试验结果可知,乳酸菌中2号产淀粉酶和纤维素酶,芽孢杆菌中7号产淀粉酶㊁纤维素酶和蛋白酶,属于产酶较多的菌株,因此选择这2株进行后续试验,并分别编号为2020V 1和2020V 2㊂1872中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,乳酸菌;B ,牙孢杆菌A ,L a c t i c a c i db a c t e r i a ;B ,B a c i l l u s图1 分离菌株革兰氏染色镜检图(1000ˑ)F i g .1G r a ms t a i n i n g m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o no f t h e i s o l a t e d s t r a i n s (1000ˑ)表2 细菌生化试验结果T a b l e 2 B a c t e r i a l b i o c h e m i c a l t e s t r e s u l t s 菌株编号N u m b e r o f s t r a i n s硝酸盐还原N i t r a t e r e d u c t i o n淀粉酶A m yl a s e 硫化氢H y d r o ge n s u lf i d e 纤维素酶C e l l u l a s e蛋白酶P r o t e a s e接触酶试验C o n r a c t e n z ym e 1++――――2―+++――3+―++――4++―――+5+++――+6――――++7―+++++8―+―+―+9+―――+++,阳性;―,阴性㊂表3同+,P o s i t i v e ;―;N e ga t i v e .T h e s a m e a s t ab l e 32.2 细菌种属的鉴定由图2可知,1.0%琼脂糖凝胶电泳结果表明2株细菌D N A 大小均在1600b p 左右㊂由图3㊁4可知,2020V 1菌株和N C B I 库中序列编号K U 601351.1的细菌进化距离为100,相似性为99.9%;2020V 2菌株和N C B I 库中序列编号MT 975238.1的细菌进化距离为100,相似性为99.9%,因此确定2020V 1为特基拉芽孢杆菌C C 2F G 2,2020V 2为类肠膜魏斯氏菌J Y 0R 2㊂1~4,2020V 1;5~9,2020V 2;M ,D L 2000D N A M a r k e r 1-4,2020V 1;5-9,2020V 2;M ,D L 2000D N A M a r k e r 图2 2020V 1和2020V 2菌株P C R 结果F i g.2 P C Rr e s u l t s o f 2020V 1a n d 2020V 2s t r a i n s 28727期魏 笑等:鹅粪便中特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌的分离鉴定图3 2020V 1(A )和2020V 2(B )菌株基于16S r D N A 基因的进化树F i g .3 E v o l u t i o n a r yt r e e b a s e do n t h e 16S r D N A g e n e o f 2020V 1(A )a n d 2020V 2(B )s t r a i ns 图4 2020V 1(A )和2020V 2(B )菌株相似性比对F i g .4 S i m i l a r i t y c o m pa r i s o no f 2020V 1(A )a n d 2020V 2(B )s t r a i n s 3872中国畜牧兽医49卷2.3细菌生长曲线由图5可知,2020V1菌株的菌液浓度从4h开始迅速增加,到16h时到达对数生长期顶峰,随后进入稳定期,浓度变化不大;2020V2菌株在培养4h后菌液浓度大幅增加进入对数生长期,18h时进入生长稳定期浓度不再发生较大波动㊂因此后续试验中为获得最高活菌数,2020V1菌株至少培养16h,2020V2菌株至少培养18h㊂图52020V1和2020V2菌株生长曲线F i g.5G r o w t h c u r v e o f2020V1a n d2020V2s t r a i n s2.4细菌培养基酸碱度测定由图6知,2020V1菌株在p H为6.5的环境下生长较好,2020V12菌株在p H为6.0的偏酸性环境下生长状况良好㊂图6不同p H下2020V1和2020V2菌株的浓度F i g.6C o n c e n t r a t i o n o f2020V1a n d2020V2s t r a i n sa td i f fe r e n t p H2.5细菌适宜培养温度测定由图7可知,2020V1菌株在环境温度为36ħ时D600n m值最高,且随着温度升高D600n m值逐渐降低;2020V2菌株在36.5ħ时D600n m值最高,36.5ħ前后随着温度的降低或升高,D600n m值均降低㊂2.6酸性和高胆盐浓度环境下细菌存活率测定2020V1和2020V2菌株在酸性和高胆盐浓度浓度环境下的存活率如表3和4所示㊂由表3可知,在p H=3.5环境下2株菌均能生长繁殖,且存活率超过半数,说明2株菌都具有耐酸能力㊂由图7不同温度下2020V1和2020V2菌株的浓度F i g.7C o n c e n t r a t i o no f2020V1a n d2020V2s t r a i n sa td i f fe r e n t t e m p e r a t u r e表4可知,2020V1菌株能在1.5%胆盐浓度环境下生长繁殖,且存活率超过半数,2020V2菌株在1.2%胆盐浓度环境下存活超过半数,说明2株菌均具有较好的耐胆盐能力,且2020V1菌株的耐受力高于2020V2菌株㊂表3不同p H环境下2020V1和2020V2菌株的存活率T a b l e3S u r i v a l r a t eo f2020V1a n d2020V2s t r a i n su n d e rd i f fe r e n t p H%菌株S t r a i n sp H2.02.53.03.54.02020V120.431.756.281.592.22020V24.87.985.187.692.4 48727期魏 笑等:鹅粪便中特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌的分离鉴定表4 不同胆盐浓度下2020V 1和2020V 2菌株的存活率T a b l e 4 S u r i v a lr a t eo f2020V 1a n d2020V 2s t r a i n su n d e r d i f f e r e n t b i l e s a l t c o n c e n t r a t i o n s %菌株S t r a i n s 胆盐浓度B i l e s a l t c o n c e n t r a t i o n s/%0.30.60.91.21.52020V 187.384.076.469.267.92020V 276.073.056.750.649.22.7 抗菌药耐受性的测定由表5可知,20202V 1菌株对头孢呋辛㊁头孢唑林㊁头孢噻肟㊁氨苄西林㊁呋喃妥因㊁环丙沙星㊁庆大霉素和四环素不敏感;对氧氟沙星㊁诺氟沙星㊁卡那霉素㊁链霉素㊁克拉霉素㊁红霉素㊁复方新诺明和万古霉素敏感㊂2020V 2菌株对头孢呋辛㊁头孢唑林㊁头孢噻肟㊁氨苄西林㊁复方新诺明㊁万古霉素㊁庆大霉素和链霉素不敏感;对呋喃妥因㊁四环素㊁卡那霉素中度敏感;对氧氟沙星㊁诺氟沙星㊁环丙沙星㊁克拉霉素和红霉素敏感㊂表5 2020V 1和2020V 2菌株药物敏感试验结果T a b l e 5 D r u g s e n s i t i v i t yt e s t r e s u l t s o f 2020V 1a n d 2020V 2s t r a i n s 抗菌药名称A n t i b i o t i c s 2020V 12020V 2抑菌圈直径D i a m e t e r o f i n h i b i t i o nz o n e /m m耐药性S e n s i t i v i t y抑菌圈直径D i a m e t e r o f i n h i b i t i o nz o n e /m m耐药性S e n s i t i v i t y头孢呋辛C e f u r o x i m e 10R 8R 头孢唑啉C e f a z o l i n12R 12R 头孢噻肟C e f o t a x i m e s o d i u m 13R 10R 氨苄西林A m p i c i l l i n 10R 8R 呋喃妥因F u r a n t o i n14R 15I 复方新诺明P a e d i a t r i c c o m po u n d s u l f a m e t h o x a z o l e t a b l e t s 31 S8 R氧氟沙星O f l o x a c i n 32S 22S 诺氟沙星N o r f l o x a c i n32S 24S 环丙沙星C i p r o f l o x a c i n 14R 27S 万古霉素V a n c o m y c i n 22S 8R 链霉素S t r e p t o m y c i n 21S 11R 庆大霉素G e n t a m i c i n 8R 11R 克拉霉素K l a r i c i d 30S 21S 卡那霉素K a n a m y c i n 23S 17I 红霉素E r y t h r o m yc i n 33S 20S 四环素T e t r a c yc l i n e 10R 14I 3 讨 论特基拉芽孢杆菌和类肠膜魏斯氏菌均属于畜牧生产益生菌[8-9],也是组成畜禽肠道微生物群落重要的成员㊂P r a d h a n 等[10]研究发现,特基拉芽孢杆菌可通过产生脂肽及生物表面活性剂等物质破坏病原菌的生物膜,从而起到抑菌作用㊂特基拉芽孢杆菌可提高血清溶菌酶㊁脂肪酶和肝脏谷丙转氨酶的活性,从而达到促进消化㊁提高免疫的作用[11]㊂在自然界中类肠膜魏斯氏菌是一类广泛分布于肉类㊁新鲜果蔬㊁发酵食物㊁青贮饲料中的乳酸菌[12],其可广泛定植于宿主肠道[13-14]㊂研究发现,魏斯氏菌应用于食品发酵时,可合成葡聚糖和果聚糖等低聚糖,这些低聚糖可促进人体对微量元素的吸收,减轻人体肠胃不适,促进双歧杆菌增殖[15]㊂本试验中,2020V 1菌株属于芽孢杆菌属中的特基拉芽孢杆菌,2020V 2菌株属于乳酸菌属中的类肠膜魏斯氏菌,2株菌均具有较强的耐酸耐胆盐能力,能够在肠道中定植并发挥作用,并能与部分抗菌药联合用药㊂2020V 1和2020V 2菌株作为微生物制剂的潜在益生菌,需测定其生长特性和耐酸耐胆盐能力以确定能否经过口腔进入消化道,通过胃液和胆汁最终定植并发在肠道发挥作用㊂2020V 1和2020V 2菌株在p H 为3.5环境下存活率分别为81.5%和87.6%,在胆碱浓度为1.2%环境下存活率分别为5872中国畜牧兽医49卷69.2%和50.6%,均超过p H=7和无胆盐组半数,证明2种微生物可以通过胃酸和胆汁且活菌数仍然保持在正常范围,说明其能够顺利定植在肠道发挥作用,这与樊炳君等[16]和李文等[17]试验结果相符㊂2020V1菌株的生长特性研究结果表明,在4h达到对数生长期,在36ħ㊁p H为6.5的环境下培养较好,这与王旭[18]的生长特性研究一致㊂2020V2菌株的生长特性结果表明,在4h达到对数生长期,在36.5ħ㊁p H为6的环境下进行培养最为适宜,与高静等[19]研究结果相符合㊂为确定2020V1和2020V2菌株对抗菌药的耐受性,采用美国S C L A抗微生物敏感性试验执行标准M100作为耐药㊁敏感和中介值进行判定㊂选择与抗菌药同时使用时,注意选择那些可相容的抗菌药,试验结果显示,2020V1菌株能耐受部分β-内酰胺类㊁硝基呋喃类㊁喹诺酮类㊁氨基糖苷类㊁四环素类抗菌药,与郭佳等[20]研究的芽孢杆菌菌抗菌药耐受部分结果一致,部分结果不同可能是因为菌种虽然同属但不同种,微生物自身携带的耐药基因不同所导致,这需要后续试验来证明;2020V2菌株能耐受部分β-内酰胺类㊁磺胺类㊁糖肽类㊁氨基糖苷类抗菌药,这与部分乳酸菌对抗菌药耐受性结果一致㊂在本研究中,通过分离得到2020V1和2020V22株益生菌,其对抗菌药具有不同程度的耐受性,可为将来在动物治疗过程中抗菌药的选用提供理论依据㊂4结论本研究成功从健康成年北方白鹅直肠粪便中分离到9株细菌,生化试验鉴定为特基拉芽孢杆菌C C2F G2和类肠膜魏斯氏菌J Y0R2,2种菌均具有耐酸㊁耐胆盐的特性㊂特基拉芽孢杆菌C C2F G2能与β-内酰胺类㊁喹诺酮类和四环素类四环素联合使用;类肠膜魏斯氏菌J Y0R2能与β-内酰胺类㊁磺胺类㊁糖肽类㊁氨基糖苷类联合使用㊂该结果可为鹅源功能菌的研发及其对抗菌药的选用提供思路㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]孙露,单潇潇,蒋建兰,等.一株对稻瘟病菌有抗菌活性的特基拉芽孢杆菌W R N032的筛选及发酵条件优化[J].天然产物研究与开发,2020,32(5):860-866.S U NL,S HA N X X,J I A N GJL,e ta l.S c r e e n i n g o fB a c i l l u s t e q u i l e n s i s WR N032w i t h M a g n a p o r t h eo r y z a e a n d i t s o p t i m i z a t i o n o f f e r m e n t a t i o nc o nd i t i o n s[J].N a t u r a l P r o d u c t Re s e a r c h a n dD e v e l o p m e n t,2020,32(5):860-866.(i nC h i n e s e)[2]周瑚,邹秋霞,胡玲,等.特基拉芽孢杆菌J 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两种粪肠球菌的分离方法比较韩镌竹;李欣南;苏葳艺;杨文腰【摘要】本研究利用采集的鸡泄殖腔和猪肛门拭子样本400份，采用两种方法分离粪肠球菌并进行对比。

结果显示，两种方法对4类样品中粪肠球菌的分离率分别为22%、33%、23%、22%（方法Ⅱ）和86%、91%、87%、82%（方法Ⅱ），说明建立了准确、高效、可靠的粪肠球菌分离方法。

%400 swab samples collected from chicken cloaca and pig anus were used to compare two methods to separation and purification of enterococcus faecalis. The separation rates of the two methods were 22%、33%、23%、22% (MethodⅠ) and 86%、91%、87%、82% (Method Ⅱ). Thus the accurate, fast and reliable method of separation was established.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P5-9)【关键词】粪肠球菌;分离纯化;方法比较【作者】韩镌竹;李欣南;苏葳艺;杨文腰【作者单位】辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳 110016;辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳 110016;辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳 110016;辽宁成大生物股份有限公司，辽宁沈阳110179【正文语种】中文【中图分类】S858.23肠球菌属于1984年从链球菌属中分离出来成为独立的新菌属[1-2]，现根据DNA 同源性，将其列为肠球菌属，属肠（见兽医微生物学第五版第90页）球菌科。

肠球菌在自然界分布广泛，是水、空气、尘埃、人及动物粪便以及健康上呼吸道的常在菌，粪肠球菌和屎肠球菌是引起医院内感染的主要肠球菌种[3]，已经成为医院内感染的第二大病原[4-6]，但在动物医学领域，对该病原的研究很少[7-9]。

黑龙江省部分地区鹅致病性大肠杆菌血清型鉴定及药敏试验赵阳;王艺萌;张文龙;马波;王君伟【摘要】收集来自黑龙江省部分地区的疑似鹅大肠杆菌致死鹅的肝脏、心脏、肺脏、肾脏等组织样本,用于进行大肠杆菌分离培养.经形态观察,生化试验,共鉴定出61株大肠杆菌.经血清型鉴定,表明O9、O18、O64、O93这4种血清型在黑龙江省内分布广泛,为优势血清型.药敏试验表明,分离菌株呈现出不同程度的耐药性,临床常用的庆大霉素、氨苄青霉素、氟哌酸抑菌作用很弱,而妥布霉素,四环素,阿米卡星类对分离菌株几乎无抑制作用.耐药率低于33％的仅有3种,分别是先锋噻肟,复达欣,菌必治,以上3种药物可以作为临床用药的候选药物.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2011(047)011【总页数】3页(P20-22)【关键词】鹅;禽致病性大肠杆菌;血清型鉴定;药敏试验【作者】赵阳;王艺萌;张文龙;马波;王君伟【作者单位】东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S852.61+2我国是世界上养鹅数量和鹅食品消费量最多的国家。

随着集约化养殖的普及，鹅致病性大肠杆菌对养鹅业的危害和导致的经济损失日益严重，成为目前危害养鹅业传染病之一。

鹅大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏杆菌所引起的一种传染病，不同品种和日龄的鹅均可发病，但仔鹅最易感。

在临床上主要表现为败血症、纤维素性气囊炎、肝周炎、心包炎和腹膜炎。

近年来，随着抗菌药物的大量应用，耐药菌株不断出现，鹅大肠杆菌病的发生有逐年上升的趋势，部分地区鹅大肠杆菌病的流行情况已比较严重。

本试验从黑龙江省部分地区中分离了鹅致病性大肠杆菌，并对鉴定出的大肠杆菌进行血清型分析和药敏试验，为了解鹅大肠杆菌病在本省的流行情况，指导用户选择合适的治疗药物以及制定科学的防治措施提供部分参考依据。

收稿日期：2020-02-25基金项目：科技部农业成果转化项目（2013GB2B200131）；黑龙江省科技成果转化推广项目（2019）作者简介：高丽，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：朱战波，E-mail：******************.cn ·研究论文·黑龙江省大庆地区鹅源大肠杆菌的分离鉴定及毒力基因检测摘 要：为了研究黑龙江省大庆地区鹅源大肠杆菌流行株的毒力基因分布情况。

从大庆周边6个地区鹅养殖场发病鹅体内分离大肠杆菌，采用PCR 方法及K-B 纸片法进行了毒力基因检测和药敏试验。

结果表明：53株大肠杆菌分离鉴定出48株大肠杆菌含有毒力基因，以气杆菌素iucD （48/53，91 %）、强毒力岛FyuA （27/53，51.3%）、黏附素I 型菌毛FimH （38/53，71.1%）、大肠杆菌外膜蛋白ompA （47/53，89%）为主要毒力基因；抗生素敏感率最高为庆大霉素和呋喃妥因；耐药率最高为四环素、复方新诺明和环丙沙星。

本研究为黑龙江地区鹅大肠杆菌病的预防和控制提供了数据资料。

关键词：大庆地区；鹅；致病性大肠杆菌；毒力基因；耐药性中图分类号：S852.61文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）04-0144-06Isolation Identifi cation and Virulence Gene Detection of E. coli from Goose inDaqing Areas of Heilongjiang ProvinceGAO li 1, FU Jinlei 1, HUANG Wenjing 1, WU Chenhua 1, LIU Siyu 1, ZHAO Tong 1, YUE shan 1, CHEN Nannan 1, XU Weiwei 1, LIU Yu 1,2, ZHANG Zecai 1,2, ZHOU Yulong 1,2, ZHU Zhanbo 1,2(1. College of animal science and technology, Heilongjiang Bayi agriculture university, Daqing 1633192, China; 2. Goose Industry ResearchInstitute of Heilongjiang Bayi Land Reclamation University, Daqing 163319, China)高 丽1，付金蕾1，黄雯静1，吴陈华1，刘思雨1，赵 童1，岳 山1，陈楠楠1，徐维维1，刘 宇1,2，张泽财1,2，周玉龙1,2，朱战波1,2（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学鹅业研究所，大庆163319）Abstract: In order to study the distribution of virulence genes of goose-derived Escherichia coli strains in Daqing area, Heilongjiang province, bacterial isolation, identifi cation and detection of virulence genes were performed in the present study. Escherichia coli isolation was performed for samples from diseased geese on six goose farms around Daqing area and the detection of virulence genes were carried out by PCR and drug susceptibility testing by K-B paper method. Total 53 E. coli strains were isolated and identified, of which 48 strains contained virulence genes, i.e., aerobicin iucD (48/53, 91%), strong virulence island FyuA (27/53, 51.3%), adhesin I Type fi mbriae FimH (38/53, 71.1%) and E. coli outer membrane protein ompA (47/53, 89%). The most susceptible drugs were gentamicin and nitrofurantoin, and the most resistant drugs were tetracycline, compound trimethoprim and ciprofl oxacin. The results of this study provided data for the prevention and control of goose colibacillosis in Heilongjiang.Key words: Daqing area; Goose; pathogenic Escherichia coli ; virulence gene; resistanceChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2023,31(4):144-149· 145 ·高 丽等：黑龙江省大庆地区鹅源大肠杆菌的分离鉴定及毒力基因检测第31卷第4期大肠杆菌是人和许多动物体内的正常菌，一些特殊血清型常引起严重腹泻和败血症[1]。

一株鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组序列分析的开题报告一、研究背景鹅呼肠孤病毒（Goose astrovirus，GoAstV）是属于天然矮星病毒科（Astroviridae）的一种RNA病毒，它能够引起鹅的消化道疾病，包括呕吐、腹泻等。

这种病毒在全球范围内都有分布，已经成为鹅养殖业的一个重要问题。

目前，针对鹅呼肠孤病毒的研究还比较有限，主要集中在病毒的分离、鉴定、分子特征、病毒学结构、流行病学等方面，尚未对其全基因组进行系统性的分析。

因此，开展一项关于鹅呼肠孤病毒分离鉴定及全基因组序列分析的研究具有重要意义和广阔的应用前景。

二、研究目的1.对一株鹅呼肠孤病毒进行分离鉴定，并对其进行基础的生物学特性研究；2.通过测序和分析，得到该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列，并对其进行系统性的遗传学和进化学分析；3.探究该病毒的种系进化关系，并分析其与其他已知鹅呼肠孤病毒的相似性和差异性；4.为进一步深入研究鹅呼肠孤病毒的基础病原学与流行病学特征以及防控技术的研发提供技术支持。

三、研究方法1.样品采集及鉴定：从鹅粪便样品中，通过筛选、纯化、传代等方法，筛选出一株鹅呼肠孤病毒，并进行鉴定；2.病毒RNA提取：对提取的病毒RNA进行反转录，得到其对应的cDNA片段；3.PCR扩增及双向测序：将cDNA片段进行PCR扩增，随后通过高通量测序得到该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列；4.序列分析及进化分析：对该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列进行分析，包括GC含量、核苷酸序列的一致性、氨基酸序列的一致性、基因的数量和排列特点、启动子和编码序列等。

另外，还对其进行系统发育学分析、计算进化树、相似性度量和重组分析，探究其种系进化关系。

四、预期结果1.成功分离鉴定出一株鹅呼肠孤病毒，并初步分析了其基础生物学特性；2.得到该病毒的全基因组序列，并对其进行深入分析；3.研究其种系进化关系，探究其与其他已知鹅呼肠孤病毒的相似性和差异性；4.为防控鹅呼肠孤病毒的流行提供重要技术支撑。