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定向诱导分化环境下骨髓间充质干细胞向成骨及成脂细胞的分化赵勤鹏【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)032【摘要】BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cels are non-hematopoietic stem cels from the bone marrow and can differentiate into chondrocytes, osteocytes and adipocytes under different induction conditions, which are the most promising seed cels for tissue engineering. <br> OBJECTIVE:To evaluate the osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cels under directional induction. <br> METHODS:Bone marrow samples from Japanese rabbits were extracted asepticaly to isolate and purify bone marrow mesenchymal stem cels using density gradient centrifugation and cel adherent method. Then, the cels were cultured in osteogenic and adipogenic induction media as experimental group. Another cels cultured in DMEM medium acted as control group. Sudan IV staining, Von Kossa staining and alkaline phosphatase activity detection were performed at different time after culture to compare the osteogenic and adipogenic rates. <br> RESULTS AND CONCLUSION:After 7 days of adipogenic induction, smal lipid droplets were visible and the cels arranged disorderly; at 21 days of induction, see lipid droplets with high refractivity were seen in thecytoplasm. Sudan IV staining showed that there were a large amount of red lipid droplets in the cloning center of bone marrow mesenchymal stem cels, but only 5% bone marrow mesenchymal stem cels differentiatedinto adipocytes in the control group. At 7 days of osteogenic induction, induced cels were confluent in a flagstone shape, and there were many nodules; at 14 days of culture, the center of brown mineralized nodules were visible; at 21 days of culture, smal pieces of mineralized nodules formed. The osteogenic and adipogenic rates were 40% and 20% in the experimental group, respectively, which were higher than those in the control group (5%, 5%). These findings indicate that under certain conditions, bone marrow mesenchymal stem cels can partialy differentiate into fat cels part, and another part differentiate into osteocytes, suggesting there is a certain link between them, that is, more adipocytes and fewer osteoblasts, or vice versa.%背景：骨髓间充质干细胞属于骨髓中的非造血干细胞，能够在不同的条件下诱导分化为软骨细胞、骨细胞以及脂肪细胞等，是最有前途的组织工程种子细胞。
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
干细胞成骨诱导步骤干细胞成骨诱导啊，这可是个很有趣的过程呢！就好像是一场奇妙的旅程。
首先呢，得准备好干细胞这个“主角”呀。
它们就像是一群充满潜力的小战士，等待着被激发。
然后呢，要给它们创造一个合适的环境，就好比给小战士们准备一个舒适的营地。
这时候各种营养物质就纷纷登场啦，它们就像是小战士们的粮草，为干细胞提供能量和支持。
接下来，要加入一些诱导因子，这可不得了，就像是给小战士们发出了冲锋的号角！这些诱导因子会促使干细胞开始向成骨细胞的方向转变。
在这个过程中，干细胞们就像是在进行一场华丽的变身。
它们逐渐抛弃原来的模样，一点点地向成骨细胞的形态和功能靠近。
这难道不神奇吗？就好像毛毛虫变成美丽的蝴蝶一样。
随着时间的推移，干细胞们越来越像成骨细胞啦。
它们开始合成一些特殊的蛋白质和物质，这些东西就像是它们的武器和装备，让它们能够更好地完成成骨的任务。
你说这像不像一个魔法？干细胞从普普通通的样子，经过一系列的步骤，竟然能够变成坚硬的骨头的一部分！而且啊，这个过程中还需要密切的观察和精心的呵护呢。
就跟照顾小婴儿一样，要时刻关注它们的状态，确保一切都顺顺利利的。
如果稍有疏忽，那可就糟糕啦，就好比一场战斗中出现了失误，可能会影响整个战局呢！所以啊，每一个环节都不能马虎。
想象一下，如果我们能够很好地掌握干细胞成骨诱导的步骤，那对于治疗一些骨骼方面的疾病该有多大的帮助呀！那简直是给患者们带来了新的希望和曙光。
干细胞成骨诱导，这真的是一个充满挑战又让人兴奋的领域。
我们要不断地探索和研究，让这个奇妙的过程为人类的健康做出更大的贡献。
这不就是我们努力的方向吗？让这些小小的干细胞发挥出大大的能量，为我们的生活增添更多的美好和可能！总之，干细胞成骨诱导步骤非常重要，我们一定要重视起来呀！。
干细胞成骨分化原理干细胞啊，就像是细胞世界里的小魔法师。
它们有着超级神奇的能力，其中成骨分化就是它们超酷的魔法之一。
咱先来说说干细胞是啥。
干细胞就像是细胞界的小婴儿，它们还没有决定自己要变成啥样的细胞呢。
它们可以根据身体的需要，变身成各种各样的细胞，就像小婴儿可以成长为不同职业的大人一样。
这里面的间充质干细胞就特别厉害，它们就像是全能选手，有潜力变成骨细胞。
那干细胞怎么就开始成骨分化这个神奇的过程了呢？这就像是一场被信号指挥的舞蹈。
身体里会有各种各样的信号分子，就像小信号兵一样。
比如说，骨形态发生蛋白（BMP），这可是个很重要的信号分子呢。
当BMP出现的时候，就像是吹响了成骨分化的号角。
干细胞听到这个号角声，就开始蠢蠢欲动啦。
BMP就像是一个很有魅力的领舞者，它会和干细胞表面的受体结合。
这一结合可不得了，就像是打开了干细胞内部的魔法开关。
然后呢，干细胞内部就开始热闹起来啦。
各种基因就像是一群勤劳的小工匠，开始忙忙碌碌的。
像Runx2这个基因，它可是成骨分化的关键小工匠。
一旦被激活，它就开始指挥着细胞制造一些特殊的蛋白质。
这些蛋白质就像是建造房子的砖块和水泥，是构建骨头的重要材料。
比如说，碱性磷酸酶（ALP）这种蛋白质就开始多起来了。
ALP就像是一个勤劳的小助手，它会帮助调节细胞周围的环境，让这个环境变得适合骨头生长。
随着这个过程的推进，细胞也开始发生变化啦。
干细胞就像是在进行一场华丽的变身秀。
它们的形状开始变得更像骨细胞的样子，扁扁的，有好多小突起。
而且细胞内部的结构也在改变，就像重新装修房子一样。
细胞开始大量制造一种叫做胶原蛋白的东西，这胶原蛋白啊，就像是房子的框架，把整个骨头的结构支撑起来。
在这个过程中，还有钙盐的沉积呢。
钙盐就像是亮晶晶的小宝石，一点点地镶嵌到胶原蛋白构建的框架里。
这就像是给房子镶上漂亮的装饰，让骨头变得更加坚固。
慢慢地，经过这么一系列神奇的变化，干细胞就成功地变成了骨细胞，就像小魔法师完成了一个超级厉害的魔法。
大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响实验研究了解ADSCs的体外生长规律、生物学特性及成骨诱导分化能力的各种参数，已经成为目前急需解决的问题。
本研究通过探讨ADSCs的生长增殖活性以及成骨分化能力，为ADSCs是否可以成为理想的种子细胞以及进一步基础研究和临床应用提供依据。
1 材料与方法1.1 实验对象健康SD大鼠，由辽宁医学院动物实验中心提供。
1.2 方法1.2.1 ADSCs分离及原代、传代培养取SD大鼠，无菌条件下取腹股沟部脂肪组织，常规方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，置37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。
原代培养每3 d换液。
待细胞生长达到80%时，进行1∶2传代，继续培养传代。
1.2.2 贴壁细胞鉴定取第2代的ADSCs，按照试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，分为4份，分别滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。
用SABC显色试剂盒显色，倒置显微镜下观察拍照。
1.3 成骨诱导培养及指标检测取第3代细胞，分别以1×104/mL的密度接种于24孔培养板、5×104/mL的密度接种到放有盖玻片的6孔培养板中，更换为含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸的成骨诱导剂的DMEM培养基，每3 d换液。
以加入不含诱导剂培养基的3代细胞作为对照组。
1.3.1 形态学观察每日在显微镜下观察诱导后细胞的生长情况以及形态特点。
1.3.2 茜素红染色矿化结节计数取成骨诱导21 d的细胞，0.1%茜素红染色30 min，镜下观察照相。
将每孔均分为4个象限，每个象限随机取一低倍2个视野，取8视野计数均值。
2 结果2.1 贴壁细胞鉴定对第2代贴壁细胞通过免疫细胞化学染色检测了CD34、CD44、CD49 d、CD106四个细胞表面标记，结果显示贴壁细胞CD44、CD49 d阳性表达，细胞胞浆呈现棕黄色；而CD34、CD106为阴性表达，大部分细胞胞浆未着色，细胞核蓝染。
细胞成脂、成骨、成神经诱导实验服务实验操作流程：成骨诱导培养液配备与诱导操作：1、准备含10%FBS的α-MEM培养液；2、在备好的α-MEM培养液中添加50μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松；3、准备6孔培养板，将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中；4、待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液；5、每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色；6、二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。
【晶莱生物】素红染色方法介绍：1、去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次；2、使用10%甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3、按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；4、清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；5、倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。
成脂诱导培养液配备与诱导操作：1、配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；2、在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；3、准备6孔培养板，将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM培养液中4、待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。
红油O染色方法介绍：1、去除细胞使用的当前培养液，使用PBS清洗两次；2、27.5%甲醛室温固定20分钟；3、重蒸馏水清洗3此，空气中干燥；4、加入0.5%的红油室温孵育一小时；5、配制70%乙醇溶液清洗3次；6、倒置显微镜观察拍照记录。
实验注意事项：客户提供：细胞种类和诱导分化细胞类型。
交付标准：1、成功定向诱导分化的细胞。
13BIOTECHWORLD 生物技术世界1 前言间充质干细胞是由一组不同分化潜能的细胞组成的。
MSC存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、皮肤结缔组织、胚胎组织、脐带、脐血及外周血等。
由于MSC具有多向分化潜能,在一定实验条件诱导下可向不同胚层的细胞分化[1]。
2001年,Zuk [2]等从抽脂术废弃的脂肪组织中,分离出脂肪干细胞,并证明这种丰富且能再生的组织可作为未来组织工程的细胞来源。
体外实验显示在特定培养条件下,MSC可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等。
本文通过体外培养的方法从脂肪组织中筛选出ADSCs [3],进一步研究脂肪干细胞体外分离培养的方法,并进行染色和表面抗原鉴定,为ADSCs 相关研究提供参考。
2 材料与方法:2.1 样品来源:人腹部抽脂50ml 2.2 试剂PBS(磷酸盐缓冲液),Hyclone;DMEM/F-12 1:1,Hyclone;0.1% I型胶原酶;Ul troser-G,PALL;L-Glu ,GIBCO;0.25%胰酶,Life;地塞米松, SIGMA;IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤);油红O;异丙醇;75%酒精。
2.3 ADSCs 分离和培养收集脂肪组织后,加入等体积的PBS,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复离心2遍,保留上层脂肪层和下层沉淀细胞。
向含有脂肪层的离心管中加入等体积的0.1%I型胶原酶,37℃,水浴8min,加入等体积PBS 终止消化,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复消化离心3遍,最后弃去上层脂肪层。
将两次收集到的沉淀合并,用PBS洗一次,离心弃上清。
用注射用水裂解红细胞,离心收集沉淀。
取3×106个细胞接种到T175 cm 2 细胞培养瓶中,用含有2% Ul troser-G和1% L-Glu的DMEN/F-12培养,24h,次日收集细胞液,下层贴壁细胞为成纤维细胞,将细胞液重新接种到新的T175 cm 2 细胞培养瓶中,隔三天换液一次,培养期间根据细胞生长情况传代,培养到第14天时收获细胞[4]。
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。
完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。
倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。
细胞长成单层后进行传代。
细胞培养3周。
去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。
或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。
诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。
间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。
取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。
:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12,14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
③钙结节染色:Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。
本试验染色过程中未作细胞衬染。
Van kossa银染色法试剂：1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。
2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。
培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次2. 2%硝酸银内置暗处1小时3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）5. 5%硫代硫酸钠1小时1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤；3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。
1. Sections to water. 切片脱蜡至水2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes.置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟5. Wash in water. 用水漂洗6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.A 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本,1 %硝酸银溶液紫外线下染色10min ,用 5 %硫代硫酸钠染色2min ,1 %中性红复染10min ,酒精冲洗后观察。
B 组以改进的方法染色:4 %多聚甲醛固定标本,,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色30min ,蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质,继续用 5 %硫代硫酸钠染色2min ,1 %中性红复染10min ,蒸馏水漂洗后观察。
或取成骨诱导21 d 的细胞, 体积分数为0.95 的乙醇固定15 min,10 g/L 茜素红S 染液在室温下浸染10 min,去离子水洗涤3次,倒置显微镜下观察。
二、茜素红染色茜素红S中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonateCAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐；茜素红；（3）茜素磺酸钠；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。
性质：橙黄色的针状体。
溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。
1%水溶液pH2.15。
由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。
茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。
用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。
配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。
或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。
0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH 调节。
茜素红染液配方配方一茜素红染液（Ⅰ）取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。
在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。
配方二茜素红溶液（Ⅱ）取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。
配方三0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0)具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。
茜素红染色步骤1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次，2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次3、0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。
在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数钙染色法—茜素红法染色步骤1．茜素红S染液5分钟2．用丙酮洗20分钟3．丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒4. 树胶封固结果：钙累及物呈桔红色④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有）取成骨诱导7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃丙酮固定10 min, 磷酸盐缓冲液洗3 次, 5 min/ 次; 体积分数为0.03 的过氧化氢孵育10 min, 磷酸盐缓冲液洗3 次, 5 min/ 次; 血清封闭液封闭15 min,倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗4 ℃过夜, 磷酸盐缓冲液洗3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温1 h, 磷酸盐缓冲液洗3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温15 min, 磷酸盐缓冲液洗3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。
诱导脂肪方向分化诱导分化细胞以每毫升5 ×104 ,接种于培养皿中,细胞达到80 %汇合后更换成脂诱导培养液(L－DMEM 培养液,10 % FBS , 地塞米松10-6mol/L , 胰岛素10 mg/L ,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX 0.5 mmol/L ,吲哚美辛0.2mmol/L),对照组继续加常规培养液,每3 天换液一次。
在诱导6 、9 、12 、15 、18 d 时各取各组细胞进行油红O 染色,光镜下观察并摄影。
油红O配方油红O1g,异丙醇100ml或70%酒精100 ml,将油红O放入烧瓶于水浴中加温溶解或放入温箱中60℃30min,用前过滤,临用时取油红O10ml,蒸馏水10ml,两者混合后立即变成鲜红色液体,静止30mi n后过滤使用.油红O染色①固定于10%中性甲醛溶液内1～2d.②蒸馏水洗冰冻切片1 0～20μm入蒸馏水.③用70～80%异丙醇或酒精稍洗或用蒸馏水稍洗.④入油红O 染色15～25min.⑤入异丙醇或酒精或蒸馏水洗.⑥用苏木素淡染细胞核,充分水洗,用甘油明胶或用PVP封固.。
