脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。

通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养张扬;刘大诚;杨效宁【摘要】BACKGROUND:After co-culture with osteoblasts, bone marrow stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts. Whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts or not? OBJECTIVE:To observe whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts. METHODS:Adipose-derived stem cells and osteoblasts were isolated from New Zealand white rabbits. Then, passage 3 adipose-derived stem cells were co-cultured with passage 2 osteoblasts in 10%or 5%fetal bovine serum for 14 days. RESULTS AND CONCLUSION:After 7 days of co-culture, some adipose-derived stem cells became round in the two groups. After 14 days of co-culture, adipose-derived stem cells highly differentiated and differentiated cells were similar to mature osteoblasts that were positive for alkaline phosphatase staining and alizarin red staining. The mRNA expression of type I col agen and osteocalcin increased in both two group, especial y in the 10%fetal bovine serum group. These findings indicate that adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts induced by high-concentration serum culture.%背景：成骨细胞与骨髓干细胞共培养后可以诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，成骨细胞与脂肪干细胞共培养是否也能诱导向成骨细胞分化呢？目的：观察脂肪干细胞与成骨细胞共培养后能否向成骨细胞分化。

三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。

完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。

细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。

去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。

间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。

取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。

:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

细胞工程复习题一、名词解释[1]细胞工程：是指主要以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

[2]细胞融合：是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。

[3]细胞重组：从活细胞中将细胞器及其组分分离出来，再在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分重新组合，使之重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术[4]细胞培养：泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长[5]细胞全能性：指分化细胞保留全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。

[6]细胞分化：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。

[7]细胞核移植：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。

主要包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。

[8]细胞悬浮培养：是将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态的培养方式[9]细胞系：由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。

第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系[10]细胞株：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株[11]细胞凋亡：也叫程序性细胞死亡是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡[12]细胞团培养：细胞培养时，本身代谢就慢或者脆弱，细胞密度太低或者太高都会导致细胞的凋亡，死亡的细胞裂解物包裹未凋亡的细胞形成絮状物，这些絮状物在显微镜下看就是细胞聚集。

[13]体细胞核移植：体细胞核移植又称体细胞克隆，原理即细胞核的全能性，是动物细胞工程技术的常用技术手段[14]冠瘿组织：是由根癌农杆菌感染引起的植物肿瘤组织，它能在无外加植物激素的培养基上生长。

isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。

ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。

然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。

1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。

文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。

1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。

通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。

同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。

以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。

该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。

接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。

2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。

这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。

ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。

此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。

这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。

人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【摘要】背景:间充质干细胞如今在科研领域被广泛地研究和应用,许多研究认为其发挥作用的机制很大程度上依赖于其旁分泌的外泌体.目的:分离纯化人脂肪干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性.方法:采用胶原酶消化法获得人脂肪干细胞,进行细胞表面分子标志和成骨、成脂分化能力鉴定.运用超滤法从人脂肪干细胞条件培养基中提取外泌体,应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小,采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质表达.结果与结论:①人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长,细胞表面表达CD73、CD44、CD90、CD105分子,具备成脂、成骨等多向分化潜能,可证实为人脂肪干细胞;②大多数外泌体直径均在30-150 nm范围内;扫描电镜显示外泌体呈均一大小的圆杯形态;③抗体芯片显示外泌体含 FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101等多种特殊蛋白;④以上结果表明实验成功分离得到人脂肪干细胞外泌体.%BACKGROUND: Currently, mesenchymal stem cells have been widely explored and applied in scientific research field, and many studies suggest that the underlying mechanism of mesenchymal stem cells mainly relies on its exosomes. OBJECTIVE: To isolate and identify human adipose-derived stem cells and its exosomes, and to identify their biological characteristics. METHODS: Human adipose tissue was digested with collagenase l, and adipose-derived stem cells were isolated and purified. Immunophenotype, osteogenic and adipogenic abilities of adipose-derived stem cells were identified. Exosomes were isolated by using ultrafiltration method. Morphology of exosomes was observed by Nanosight and electronmicroscope. Expression of proteins in exosomes was detected by antibody array method. RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells exhibited long spindle-like or fibroblast-like appearance, expressed CD73, CD44, CD90, CD105 and had the potential to differentiate into many tissues, including bone and adipose tissues. The exosomes had the similar size, with the diameter of 30-150 nm. They possessed many proteins including FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, ANXA5, TSG101, and so on. Findings from the present study indicate the successful isolation of exosomes from human adipose-derived stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)013【总页数】6页(P2033-2038)【关键词】外泌体;干细胞;间充质干细胞;脂肪干细胞【作者】李洪超;金银鹏;王皙;李莉;王晓今;周荣;陈成伟;傅青春;程明亮【作者单位】贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市 550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市550004;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;解放军第八五医院,上海肝病研究中心,上海市 200235;贵州医科大学附属医院感染科,贵州省贵阳市550004【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，不仅能够从骨髓、脐带、脂肪中分离，也可以从脾脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺中得到，尽管其组织来源不同，但是都拥有相似的表型特征[1-4]。

1672V ol.40 No.12 Dec. 2020上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE )综述近年来，我国骨质疏松症患病率逐渐攀升。

一项最新研究[1]显示，我国骨质疏松症的总患病率为13%，总人数已超过1.78亿。

老年人是骨质疏松症的重点人群，自1982年起，我国65岁以上老年人占人口比重不断升高，2019年我国65岁以上老年人占人口比重已达到12.6%[2]。

预计到2050年，我国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[1]。

骨质疏松症使得骨质脆性增加、易于骨折，导致患者的生活水平急剧下降。

利用脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells ，ADMSCs ）诱导成为成骨细胞治疗骨质疏松症是医学研究的新方向[1]。

ADMSCs 可以通过旁分泌功能，分泌一些生物活性分子，为组织修复建立良好的微环境，促进新生血管的形成和伤口愈合，并且减少组织的炎症反应。

ADMSCs 也可分泌促进血管生成和抗凋亡潜能的生长因子，如转化生长因子（transforming growth factor ，TGF ）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor ，IGF ）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF ）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor ，HGF ）[3]和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein ，BMP ）家族BMP-2、BMP-7等[4]。

ADMSCs 来源丰富，通过脂肪抽吸术易于获得，无免疫排斥。

平均每300 mL 脂肪组织可获得108个 细胞，每克动物脂肪可获得5 000个成纤维集落形成单位（colony forming unit-fibroblast ，CFU-F ）[5]。

Choukroun's PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响作者：刘元媛柳大烈南华黄佳诚单磊来源：《中国美容医学》2013年第01期[摘要]目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun's PRF（Choukroun's platelet-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。

方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs，采用Choukroun法制备自体PRF备用，观察细胞生长情况。

取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定，并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。

将第3代ADSCs 分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养，观察细胞生长情况，培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。

另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不含PRF的普通培养基（空白组）进行培养，第7天、14天、21天、28 天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测；诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。

结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形，向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性，流式检测鉴定CD29、CD90为阳性，CD45为阴性。

CCK-8法示PRF组Ⅰ的OD值均大于对照组Ⅰ，两组比较差异均有统计学意义（P[关键词]自体PRF；人脂肪来源干细胞（ADSCs）；增殖；成骨分化[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0040-03The effect of Choukroun's PRF on the proliferation and osteogenetic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitroLIU Yuan-yuan，LIU Da-lie，NAN Hua，HUANG Jia-cheng，SHAN Lei（Department of Plastic and Aesthetic，Zhujiang Hospita of Nanfang Medical University，Guangzhou 510282，Guangdong，China）Abstract： Objective To observe the effect of Choukroun's PRF （Choukroun's platelet-rich fibrin） on the proliferation and osteogenetic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro. Methods Human ADSCs （adipose-derived stem cells） were isolated from adipose tissue obtained from donor undergoing liposuction and were cultured，and autologous PRF was prepared by Choukroun method，and growth condition of ADSCs was observed.ADSCs at passage 3 were cultured in adipogenic，osteogenetic and neurospheres differentiation medium and underwent identification，flow cytometric analysis for cell surface antigen CD29，CD45 and CD90 wereperformed. ADSCs at passage 3 cultured by common culture medium containing PRF （PRFgroupⅠ）， and cultured by common culture medium without PRF （control groupⅠ）. Growth condition of the cells was observed by inverted microscope. CCK-8 method was used to observe cell proliferation activity 1，3，5，7 days after culture. Then ADSCs cultured by osteogenic induction culture medium containing PRF （PRF groupⅡ）， cultured by osteogenic induction culture medium without PRF （control groupⅡ） and cultured by common culture medium without PRF （blank group）.ALP activity detection was conducted 7，14，21 and 28 days after culture. Von Kossa staining was performed on the three groups 7 and 14 days after culture to detect the formation of calcium nodule. Results Most ADSCs at passage 3 were spindle-shaped under the inverted microscope. Adipogenic ， osteogenetic and neurospheres differentiation were positive， and flow cytometric analysis of CD29 and CD90 were positive，CD45 were negative. CCK-8 method revealed the Optical Density value of PRF groupⅠwere all greater than control groupⅠ，and there were significant diferences between two groups （PKey words：Autologous PRF； human adipose-derived stem cells； cell proliferation；osteogenetic differentiation国内外许多研究已经证明血小板浓缩物被激活后可释放出多种细胞生长因子，1984年，Assion从人血浆提取富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），大量研究表明PRP内富含血小板，血小板脱颗粒后，可以释放大量生长因子，可促进软硬组织愈合再生，已应用于整形美容和创伤外科等领域[1-2]。

成骨细胞向脂肪细胞和骨细胞分化的研究进展成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓基质干细胞，在一定条件下两者可以相互转化。

骨细胞是由嵌入骨基质的成骨细胞分化而来，但在研究骨细胞功能时发现骨细胞有去分化为成骨细胞的趋势。

本文结合最新研究，简要介绍成骨细胞、骨细胞和脂肪细胞与它们关键性基因的相关性，着重叙述成骨细胞向脂肪细胞横向分化及可能机制，同时叙述了成骨细胞向骨细胞分化相关研究，供同行参考、借鉴。

标签：成骨细胞；脂肪细胞；骨细胞；横向分化【Abstract】Osteoblasts and adipocytes are derived from bone marrow stromal cells. Both of them have transdifferentiation each other under a certain condition. Osteocytes are differentiated from osteoblasts embedded in the bone matrix，but found in research of bone cell function，osteocytes have the tendency to dedifferentiate into osteoblasts.This paper introduces the correlation of osteoblasts，osteocytes ，adipocytes and their key genes combined with the latest research，and emphasizes the differentiation from osteoblasts into adipocytes and its possible mechanism，and it also narrates the research of differentiation from osteoblasts into osteocytes for reference to the colleagues.【Key words】Osteoblast；Adipocyte；Osteocyte；Transdifferentiation成骨细胞在骨代谢中发挥了的重要作用，其分化成熟、功能活动及归属对骨质疏松等代谢性疾病的发生发展意义深远。

人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。

实验研究小鼠骨髓和脂肪间充质干细胞定向分化能力的比较研究钟家帅，冯玉梅△摘要：目的探讨小鼠骨髓源性间充质干细胞（BM-MSCs）和脂肪源性间充质干细胞（AD-MSCs）的定向分化能力。

方法从C57BL/6J小鼠股骨骨髓和腹股沟白色脂肪组织中分别分离和培养BM-MSCs和AD-MSCs，分别使用成骨、成软骨和成脂诱导分化培养基诱导两种细胞定向分化。

采用茜素红、阿利新蓝和油红O染色检测成骨、成软骨和成脂分化程度；实时荧光定量PCR（qPCR）鉴定MSCs并检测定向分化相关基因Runx2、Sp7（成骨），Sox9、Col2a1（成软骨），Pparg和Cebpa（成脂）表达水平，确定细胞的定向分化能力。

基于GEO数据库中GSE43804和GSE122778数据集的小鼠和人类BM-MSCs和AD-MSCs基因表达谱数据，分析差异表达基因及其富集的信号通路。

结果分离培养得到的BM-MSCs和AD-MSCs细胞形态不同，AD-MSCs梭形形态更明显；两种细胞均表达CD29、CD44和CD90，不表达CD34和CD45。

定向诱导后AD-MSCs的成骨和成脂分化程度高于BM-MSCs，而成软骨分化程度低于BM-MSCs （P＜0.05）；定向诱导后AD-MSCs中Runx2、Pparg和Cebpa mRNA表达水平高于BM-MSCs，Sox9mRNA表达水平低于BM-MSCs（P＜0.05）。

小鼠和人的AD-MSCs高表达的基因富集于PPAR和WNT信号通路，BM-MSCs高表达的基因富集于软骨和骨发育信号通路。

结论小鼠AD-MSCs成骨和成脂分化能力强于BM-MSCs，而成软骨分化能力弱于BM-MSCs，PPAR、WNT、软骨和骨发育信号通路的活化状态在决定BM-MSCs和AD-MSCs不同定向分化潜能中起重要调节作用。

关键词：间质干细胞；骨髓；脂肪类；PPARγ；Wnt信号通路；成骨分化；成软骨分化；成脂分化中图分类号：R329.24文献标志码：A DOI：10.11958/20230437Comparative study on the directed differentiation ability of mouse bone marrow andadipose-derived mesenchymal stem cellsZHONG Jiashuai,FENG Yumei△Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer;Tianjin's ClinicalResearch Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Department of Biochemistry and Molecular Biology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin300060,China△Corresponding Author E-mail:**************.cnAbstract:Objective To investigate the targeted differentiation ability of mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells(BM-MSCs)and adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs).Methods BM-MSCs and AD-MSCs were isolated and cultured from bone marrow of femur and white adipose tissue of groin of C57BL/6J mice respectively,and the two types of cells were induced by osteogenic,chondrogenic and adipogenic differentiation medium respectively.Alizarin red,alcian blue and oil red O staining were used to detect the differentiated degree of osteogenic,chondrogenic and lipogenic differentiation.Real-time fluorescence quantitative PCR(qPCR)was used to identify MSCs and detected expression levels of directed differentiation-related genes Runx2,Sp7(osteoblast),Sox9,Col2a1(chondroblast),Pparg and Cebpa(lipogenesis)to determine the directed differentiation ability of cells.Based on gene expression profiles of mouse and human BM-MSCs and AD-MSCs in GEO database GSE43804and GSE122778,the differentially expressed genes and their enrichment signal pathways were analyzed.Results The cell morphology of BM-MSCs and AD-MSCs obtained by isolation and culture was different,and spindle-shaped morphology was more obvious in AD-MSCs.Both cells expressed CD29,CD44and CD90,but did not express CD34and CD45.AD-MSCs showed higher osteogenic and lipogenic differentiation than those of BM-MSCs after directed induction,while chondrogenic differentiation was lower in AD-MSCs than that of BM-MSCs(P＜0.05).After directional induction,expression levels of Runx2,Pparg and Cebpa mRNA were higher in AD-MSCs than those in BM-MSCs,and Sox9mRNA expression levels were lower than those in BM-MSCs(P＜0.05).Highly expressed genes of AD-MSCs in mice and human were enriched in PPAR and WNT signaling pathways.Highly expressed genes of BM-MSCs were基金项目：天津市医学重点学科（专科）建设项目（TJYXZDXK-009A）作者单位：天津医科大学肿瘤医院，国家恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所生物化学与分子生物学研究室（邮编300060）作者简介：钟家帅（1999），男，硕士在读，主要从事肿瘤分子生物学方面研究。

人胶质瘤U251细胞定向诱导分化为脂肪细胞王景文;杨勇;张志坚;陈波;苏春香;胡昌龙;蔡慧敏;李巧玉【摘要】目的:探讨人胶质瘤U251细胞的干细胞特性及定向诱导分化为脂肪细胞的潜能.方法:采用免疫荧光染色检测U251细胞中干细胞标志物巢蛋白,人类婆罗双树样基因4(sal-like 4,SALL4),神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达.采用成脂培养基诱导U251细胞,以CCK-8实验描记细胞生长曲线;油红-O染色及免疫印迹法检测脂肪细胞标志蛋白的表达.结果:胶质瘤细胞U251中巢蛋白,SALL4,NCAM,GFAP呈阳性表达;成脂诱导培养基定向诱导后,U-251细胞内大量橙红色脂滴形成;脂肪酸合酶、过氧化物酶体增殖物受体γ (PPARγ)、CCAAT增强子蛋白-β(CEBP-β)、脂联素表达增高.结论:人胶质瘤U251细胞具备干细胞表型,可定向诱导分化为脂肪细胞.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(026)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】胶质瘤细胞;干细胞特性;脂肪细胞;诱导分化【作者】王景文;杨勇;张志坚;陈波;苏春香;胡昌龙;蔡慧敏;李巧玉【作者单位】江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002;江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002;江苏大学医学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院神经外科,江苏镇江212002【正文语种】中文【中图分类】R329.21［Abstract］ Objective：To investigate the stem cell characteristics of human glioma cell line U251 and its potential of differentiating into adipocytes．Methods：Immunofluorescence staining was used to detect the expression of stem cell marker nestin，sal-like 4（SALL4），neural cell adhesion molecule（NCAM），glial fibrillary acidic protein（GFAP）inU251 cells．Growth curve of U251 cells after adipogenic induction was evaluated by CCK-8 method．After the induction，fat deposition was stained by Oil Red O staining and adi-pogenic marker expression was detected by Western blotting．Results：U251 cells showed immunofluores-cence positive staining of nestin，SALL4，NCAM，GFAP．After adipogenic induction，a large number of or-ange-red lipid droplets was seen in U-251 cells；Western blotting showed increased expression of adipocyte-specific proteins，such as fatty acid synthase，proliferator-activated receptor gamma（PPARγ），CCAAT en-hancer-bingding protein-β（CEBP-β），adiponectin．Conclusion：U251 cells had stem cell phenotype and can be into adipocytes induction．［Key words］ glioma cells；stem cell properties；adipocytes；induced differentiation胶质瘤由神经外胚叶衍化而来的胶质细胞恶化所产生，是成年人颅内最常见的恶性肿瘤，其增殖力及侵袭力强，易复发，死亡率较高。

OSM诱导成骨分化及骨形成的研究进展抑瘤素M（OSM）是屬于IL-6家族的一类分泌型蛋白因子，在维持慢性炎症条件下机体内环境稳态中发挥重要作用。

它也是gp130膜蛋白家族的一员，在细胞增殖、分化、造血系统功能和炎症免疫等病理生理过程具有多功能调控作用。

过去很多研究报道了OSM在肿瘤、肝细胞再生、心血管疾病等疾病发生、发展中起着重要作用，对类风湿性关节炎、皮肤及肺部感染等炎症疾病也有重要的调控作用。

近年来，越来越多将研究重点聚焦于OSM对成骨分化过程中骨发生和骨成熟的调控。

1 OSM简介抑瘤素M（Oncostatin M，OSM）是IL-6家族中的一类蛋白因子，1986年Zarling等[1]首次从PMA活化U937细胞培养上清中分离纯化到一种因子，这种因子有明显抑制A375人黑素瘤细胞生长而命名为抑瘤素。

人OSM基因定位于22号染色体，基因组由3个外显子和2个内含子组成，OSM前体有252个氨基酸[2]。

OSM与白血病抑制因子（LIF）、粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-6及睫状神经营养因子（CNTF）分子之间有一定的同源性和相似的二级结构[3]。

在机体细胞微环境内，OSM可通过集落刺激因子、脂多糖（LPS）、Toll样受体配体（TLR-ligands）、前列腺素E2（PGE2）刺激中性粒细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞产生，从而参与、调节机体慢性感染性疾病及其他慢性疾病。

OSM 受体广泛分布于多种肿瘤细胞、内皮细胞和上皮细胞，在生理和病理过程中OSM 具有多种生物活性.细胞表面糖蛋白受体gp130是OSM受体的一个亚单位，是识别OSM的低亲和力受体，在组成OSM高亲和力受体中，除gp130亚单位外，还有白血病抑制因子受体（LIFR）的参与。

OSM与膜蛋白受体gp130结合后，在体内主要通过OSM受体（OSMR）和LIFR介导其生物学功能，其受体复合体gp130/OSMR、gp130/LIFR在多种细胞来源的组织中都有广泛表达。

干细胞成骨分化和成脂分化后的表征方法及原理YAO Xiang由于易分离获得、免疫原性低且具有多向诱导分化潜能，骨髓基质干细胞（Bone marrow stroma stem cells，MSCs）成为了组织工程与再生医学中理想的种子细胞。

正是由于上述原因，骨髓基质干细胞成为了很多研究者关注并使用的模型细胞。

在我的另一篇百度文献《干细胞诱导分化的方法及各类诱导试剂的配置》中已经详细介绍了骨髓基质干细胞的成骨诱导分化、成软骨诱导分化和成脂诱导分化的参考“诱导方案”及相应诱导试剂的配置和诱导试剂的详细原材料信息。

本文将侧重于介绍骨髓基质干细胞成骨和成脂诱导分化后的表征方法（包括染色表征及利用RT-PCR对相应特征性基于的表达进行表征）及相关原理，这些内容将解答我们怎样快速而有效地表征各个实验组别中成骨和成脂分化的相对强弱。

相关参考内容能够让初步涉入该领域的科研工作者极大地缩短前期探索实验和文献搜索整合所耗费的时间。

本文主要涵盖内容如下：1.成骨分化后的表征方法及原理—染色表征2.成骨分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达3.成脂分化后的表征方法及原理—染色表征4.成脂分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达5.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—染色表征6.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达注：下述各类方案经多次实验验证是行之有效的，笔者依据类似方案发表的部分参考文献如下：1. Yao X, Peng R, Ding JD*. Cell-material interactions revealed via material techniques of surface patterning. Advanced Materials, 2013;25:5257-86. (材料领域TOP期刊)2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. (生物材料领域TOP期刊)3. Yao X, Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction media. Biomaterials, 2013;34:930-9.一、成骨分化后的表征方法及原理—染色表征干细胞成骨分化后会有明显的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，一般也简写为ALP）生成，经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，未分化细胞则无明显颜色（如后面的图1或图2所示）。