骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。

干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。

在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。

在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。

2. 定向诱导干细胞分化。

3. 成长曲线测定。

4. 诱导分化后细胞鉴定。

5. 结果统计分析。

三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。

完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。

细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。

去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。

间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。

取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。

:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

骨髓间充质干细胞成软骨分化机制研究进展张佳瑶同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院修复科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心 200072刘玛丽浙江杭州师范大学 310000摘要：近年来，随着我国科技实力的不断增强，骨组织工程飞速发展，为骨修复带来了全新的期盼。

骨髓间充质干细胞是骨组织工程中的种子细胞，通过诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞能够有效治疗骨关节炎、软骨缺损等疾病，由于骨髓间充质干细胞在分化过程中不仅涉及众多信号通路，并且还会受到蛋白质、药物、RNA以及基因等多种因素的影响，因此，为进一步提升骨髓间充质干细胞在科学研究和临床中的应用效果，本篇文章将依据国内外的相关研究，对骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展展开综述。

关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；分化机制引言：骨髓间充质干细胞是一种尚未分化充分的类中胚层细胞，具有多向分化潜能，能够在特定的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞以及神经元等[1-5]。

由于骨髓间充质干细胞取材方便、对身体损伤小并免疫原性相对较低，所以，它在组织工程学中的应用非常广泛，是骨组织工程中不可或缺的种子细胞。

近年来，随着我国人口老龄化的加剧，软骨病变、骨关节炎等疾病的发病率显著提升，对广大老年人群的机体健康和日常生活造成了严重的影响。

软骨组织主要由细胞外基质和软骨细胞共同组成，属于一种结缔组织，由于该组织内缺少血管和神经支配，一般无法自我再生，再加之软骨细胞的增殖能力也非常薄弱，所以，软骨损伤通常无法自我修复，如何有效治疗软骨相关疾病一直深受医学界的关注。

随着骨组织工程的高速发展，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化在治疗软骨病变、骨关节炎等疾病中的优势作用日益凸显，但是，由于骨髓间充质干细胞成软骨在分化过程中很容易因发生肥大变性而生成纤维软骨，从而导致治疗陷入中断或者失败，故此，总结分析骨髓间充质干细胞成软骨分化机制的研究进展对于相关科学研究及临床治疗具有重要意义[6-10]。

针药结合诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的实验研究的开题报告一、研究背景和意义骨关节疾病是一种常见病，严重影响患者的生活质量。

干细胞治疗是一种新型的治疗方案，受到越来越多的关注。

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干细胞的一种，具有多向分化能力，可分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞等。

因此，BMSCs在软骨组织修复中具有潜在的应用价值。

但是，BMSCs的分化受到多种因素的影响，如环境因素、细胞因素等，因此需要寻找一种能够促进其在软骨组织修复中分化为软骨细胞的方法。

近年来，针药结合治疗在临床上应用广泛，其在激活细胞、增强组织修复等方面具有突出的作用。

因此，本研究选择针药结合的方法作为干预因素，探究其在BMSCs分化为软骨细胞方面的作用，旨在为软骨组织修复提供一种新的治疗方案。

二、研究内容和方法本研究将采用体外实验方法，收集人类BMSCs，将其分为实验组和对照组。

实验组将在不同的时间点加入针药结合液，对照组则加入普通培养液，观察两组细胞在不同时间点的形态学变化、染色体结构和分化能力的改变。

同时，采用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附法检测细胞中相关基因和蛋白质的表达水平，以评价不同时间点的分化效果。

三、研究预期结果本研究预期能够验证针药结合对BMSCs分化为软骨细胞的促进作用，并探究其机制。

同时，该研究将为软骨组织修复提供一种新的治疗思路，并为干细胞治疗提供一种新的方法。

四、研究的意义与影响本研究将在理论上探究干细胞分化的相关机制，为干细胞治疗提供新的方法和思路；在实践上为软骨组织修复提供新的治疗思路和方法，有望成为临床上治疗骨关节疾病的重要手段。

同时，本研究可能对针药结合治疗的机理进行深入探究，推动其在临床治疗中的应用和进一步发展。

诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和内皮细胞分化郭尚春;陈欣;袁霆;张长青;王金武【摘要】目的探索体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞和内皮细胞分化形成成骨细胞及内皮细胞共存体系的潜能和条件.方法采用密度梯度离心法分离培养hMSCs,采用含30 mg/L内皮细胞生长添加剂的内皮细胞诱导液诱导1周,然后更换为含1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、30 μg/mL 维生素C的成骨细胞诱导液继续诱导7～14 d.诱导前以只加10% FBS的HDMEM培养基作为对照.采用流式细胞术检测细胞表面分子,通过倒置显微镜观察细胞形态学变化.向成骨细胞诱导14 d后,采用茜素红染色观察钙结节形成.结果经流式细胞术检测,诱导前分离培养的hMSCs表达CD90、CD105和CD44,不表达内皮细胞表面标志CD34和CD133,也不表达HLA-DR.诱导14 d后,hMSCs表面标志CD90和CD105的表达下降(P＜0.05),成骨细胞表面标志CD44和HLA-DR 及内皮细胞表面标志CD34和CD133增加(P＜0.05).诱导过程中原先长梭形的细胞缩短,细胞出现分层.hMSCs向成骨细胞诱导14 d后,茜素红染色显示有钙结节形成.结论 hMSCs先后经内皮细胞诱导液和成骨细胞诱导液诱导,可在体外向内皮细胞和成骨细胞定向分化,形成内皮细胞和成骨细胞共存体系.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(029)002【总页数】4页(P154-157)【关键词】骨髓间充质干细胞;成骨细胞;内皮细胞;细胞分化;细胞表面分子【作者】郭尚春;陈欣;袁霆;张长青;王金武【作者单位】上海交通大学,第六人民医院骨科,上海市四肢显微外科研究所,上海,200233;上海交通大学,第六人民医院骨科,上海市四肢显微外科研究所,上海,200233;上海交通大学,第六人民医院骨科,上海市四肢显微外科研究所,上海,200233;上海交通大学,第六人民医院骨科,上海市四肢显微外科研究所,上海,200233;上海交通大学,第六人民医院骨科,上海市四肢显微外科研究所,上海,200233【正文语种】中文【中图分类】R329.2研究[1]表明骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能在局部微环境中重新编程，在体外可定向分化为不同类型的细胞，如成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等，可作为组织工程中不同细胞的来源。