干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤

干细胞成骨诱导步骤干细胞成骨诱导啊，这可是个很有趣的过程呢！就好像是一场奇妙的旅程。

首先呢，得准备好干细胞这个“主角”呀。

它们就像是一群充满潜力的小战士，等待着被激发。

然后呢，要给它们创造一个合适的环境，就好比给小战士们准备一个舒适的营地。

这时候各种营养物质就纷纷登场啦，它们就像是小战士们的粮草，为干细胞提供能量和支持。

接下来，要加入一些诱导因子，这可不得了，就像是给小战士们发出了冲锋的号角！这些诱导因子会促使干细胞开始向成骨细胞的方向转变。

在这个过程中，干细胞们就像是在进行一场华丽的变身。

它们逐渐抛弃原来的模样，一点点地向成骨细胞的形态和功能靠近。

这难道不神奇吗？就好像毛毛虫变成美丽的蝴蝶一样。

随着时间的推移，干细胞们越来越像成骨细胞啦。

它们开始合成一些特殊的蛋白质和物质，这些东西就像是它们的武器和装备，让它们能够更好地完成成骨的任务。

你说这像不像一个魔法？干细胞从普普通通的样子，经过一系列的步骤，竟然能够变成坚硬的骨头的一部分！而且啊，这个过程中还需要密切的观察和精心的呵护呢。

就跟照顾小婴儿一样，要时刻关注它们的状态，确保一切都顺顺利利的。

如果稍有疏忽，那可就糟糕啦，就好比一场战斗中出现了失误，可能会影响整个战局呢！所以啊，每一个环节都不能马虎。

想象一下，如果我们能够很好地掌握干细胞成骨诱导的步骤，那对于治疗一些骨骼方面的疾病该有多大的帮助呀！那简直是给患者们带来了新的希望和曙光。

干细胞成骨诱导，这真的是一个充满挑战又让人兴奋的领域。

我们要不断地探索和研究，让这个奇妙的过程为人类的健康做出更大的贡献。

这不就是我们努力的方向吗？让这些小小的干细胞发挥出大大的能量，为我们的生活增添更多的美好和可能！总之，干细胞成骨诱导步骤非常重要，我们一定要重视起来呀！。

干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。

1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2 偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。

【步骤】（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。

干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。

在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。

在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。

2. 定向诱导干细胞分化。

3. 成长曲线测定。

4. 诱导分化后细胞鉴定。

5. 结果统计分析。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。

2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。

4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。

5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。

原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。

图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。

3d换液1次，分化12d。

待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。

成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。

图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。

成骨诱导后的骨髓间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的免疫调节作用目的：探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）及成骨诱导后的骨髓间充质干细胞（OM-BMSCs）对同种异体的外周血单个核细胞（PBMCs）的免疫调节作用。

方法：分离比格犬BMSCs，成骨诱导培养基（osteogenic medium，OM）进行成骨诱导，建立BMSCs、OM-BMSCs与同种异体PBMCs的共培养体系，分三种实验条件，共9组。

A组：5×104受体PBMCs 加入5×104供体PBMCs共培养；B组：A组组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板；C组：A组组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板；D组：5×104受体PBMCs加入植物血凝素A（PHA）刺激物；E组、F组：将D组组分按B、C组方式处理；G组：5×104受体PBMCs加入IL-2炎症因子；H组、I组：G组组分按B、C组方式处理。

A、D、G组分别为三个实验条件的对照组，单独接种1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs 作为空白对照组Blank1组、Blank2组。

以上各组分别培养120h后，应用CellTiter96 Aqueous检测各组PBMCs的增殖情况。

结果：在各实验条件下与相应对照组相比较，BMSCs与OM-BMSCs均能抑制双向混合淋巴细胞反应（MLR）中PBMCs 的增殖，均能抑制经PHA刺激后PBMCs的增殖，均能抑制经IL-2刺激后PBMCs 的增殖（P＜0.01）。

结论：BMSCs及成骨分化的BMSCs对刺激细胞、PHA、IL-2刺激的同种异体PBMSs的增殖均表现为抑制效应，成骨分化后的骨髓间充质干细胞对同种异体免疫反应仍具有免疫调节作用。

标签：成骨分化；骨髓间充质干细胞；同种异体；免疫调节近年来，随着组织工程的兴起和发展，应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）构建组织工程骨已成为骨组织重建修复的一个新途径。

人脐带间充质干细胞 成骨诱导分化培养基操作手册产品描述产品规格：200mL产品货号：PD-017人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基专门为人脐带间充质干细胞成骨诱导分化而开发，针对人脐带间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方，可增加人脐带间充质干细胞的成骨 分化效果。

本产品含血清成分，仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。

人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基组成成分：成分名称添加体积175 mL20 mL2 mL2 mL2 mL400μL人脐带间充质干细胞诱导分化基础培养基 FBS 谷氨酰胺 Glutamine 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin β-甘油磷酸钠 β-Glycerophosphate 抗坏血酸 Ascorbate Acid 地塞米松B Dexamethasone200μL 染色液成分：茜素红 S 染色液10 mL 操作流程一、人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基的准备1.本产品为试剂盒型，使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。

2.使用前，请将血清置于 4℃解冻，直至血清完全溶解；待血清完全溶解后，将所有添加物置于室温溶解。

待试剂完全溶解后，轻轻摇晃使试剂混合均匀。

（注：为了保证微量试剂的 使用效果，请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心，使试剂能全部收集至管底。

）3.按上述成分表，将充分溶解混匀的 FBS 、青链霉素、谷氨酰胺、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸注：各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。

地塞米松A和地塞米松B浓度不同，不能混用。

和地塞米松B按体积大小先后加入到诱导基础培养基中；混合均匀后做好标识，培养基即可使用。

（β-甘油磷酸钠溶解性较差，必须确保完全溶解后再加入诱导培养基中）注：无菌吸取试剂管中的试剂成分，将枪头伸至培养基液面下方注入，轻微吹打洗涤枪头。

再吸取少量培养基洗涤试剂管，尽可能将所有组分完整地加到基础培养基中，保证培养基的效果。

间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法浏览： 185|更新： 2013-07-01 11:12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。

如何才能配置适合的诱导培养液呢？济南中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。

成骨诱导培养液配备与诱导操作：1.准备含 10%FBS的α -MEM培养液；2.在备好的α -MEM培养液中添加 50μ M 抗坏血酸 , 10mmβ - 磷酸甘油和 100nm地塞米松；3.准备 6 孔培养板，将 P4 细胞按照 5× 103 个 / 平方厘米的规格接种于原始α -MEM 培养液中；4.待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液；5.每三天换液一次，细胞长至 7 天时进行碱性磷酸酶染色；6.二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。

茜素红染色方法介绍：1. 去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次；2.使用 10%甲醛室温固定 15 分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3. 按照 1ml/ 孔加入 40mM的茜素红染色液，室温孵育20min 并轻微振荡；4. 清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min 重复 4 次；5.倾斜放置 2min, 吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。

成脂诱导培养液配备与诱导操作：1.配置 FBS10%含量的 HG-DMEM培养液；2.在配制完成的 HG-DMEM培养液中加入 1μ M地塞米松 ,10 μg/ml 胰岛素， 200μ M吲哚美辛和 0.5mM IBMX；3. 准备 6 孔培养板，将P4 细胞按照 2× 104 个 / 平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM 培养液中4. 待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养 2 天，在用只含有 10μg/ml 胰岛素的成脂维持培养液培养 1 天，如此交替循环培养至14 天，使用红油 O染色。

间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。

间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。

间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。

本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。

一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。

成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。

因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。

1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。

因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。

此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。

2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。

这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。

确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。

3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。

包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。

1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。

这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。

2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。

【成骨培养基】OriCell TM间充质干细胞成骨分化培养基由优化的间充质干细胞(MSC)成骨分化基础培养基、细胞培养补剂和预选胎牛血清组成。

基础培养基175 mL胎牛血清20 mL青霉素-链霉素 2 mL谷氨酰胺2 mL抗坏血酸盐400 uLβ-甘油磷酸盐 2 mL地塞米松20 uL茜素红S 10 mL一、完全培养基的制备1. 使用前，将符合MSC标准的胎牛血清于2-80℃温度下隔夜解冻或完全解冻。

轻轻旋转瓶子，确保均匀。

血清已热灭活，解冻后即可使用。

注:解冻血清中可能含有絮状沉淀物。

血清中这些物质的存在不会改变产品的性能特征。

不建议通过过滤血清来去除这些沉淀。

因此，可能会导致一些血清营养素的损失。

2.使用前约30分钟，室温解冻抗坏血酸盐、β-甘油磷酸盐、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液。

轻轻倒瓶几次，确保均匀。

3. 使用前约10分钟，在室温下解冻地塞米松。

注:取下瓶盖前，先低速离心，以保证全部内容物的回收。

4. 用70% v/v乙醇对试剂盒中每个组件的瓶/瓶外表面消毒，让乙醇蒸发。

5. 无菌打开层流罩内的瓶子/小瓶。

6. 转移全部抗坏血酸，β-甘油磷酸盐，胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液进入MSC成骨分化基础培养基。

7. 用少量基础培养基清洗每个小瓶/瓶。

然后将漂洗液倒回基培养基瓶中。

8. 转移全部地塞米松量，向瓶中加入0.5 mL的培养基，用吸管混合，再将整个混合物倒回基础培养基瓶中。

9. 重复几次步骤8。

10. 轻轻旋转全部补充(完全)的培养基，以确保混合物均匀。

现在可以使用完整的培养基了。

注:虽然本试剂盒中的每个组件都是无菌提供的，但强烈建议过滤完全培养基。

二、组织培养血管明胶涂层1. 在培养皿中加入0.1%的明胶溶液，完全盖住培养基。

2. 旋转，直到凝胶溶液均匀地覆盖整个容器底部。

在室温下放置30分钟。

3. 将所有明胶溶液吸出，并在层流罩/生物安全柜内打开的容器中放置不超过30分钟，使残留的明胶溶液蒸发。