干细胞成骨分化和成脂分化后的表征方法及原理
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干细胞的分化调控机制干细胞是一类能够自我复制并能够分化成多种不同细胞类型的细胞。
由于它们具有这种多能性,因而被认为是一种非常重要的细胞类型。
干细胞的不同分化能力和成体细胞的分化能力有所不同,干细胞可以分化成更多的不同细胞类型,而成体细胞的分化能力则受到限制。
因此,研究干细胞的分化调控机制是非常重要的。
干细胞的分化调控机制是如何实现的呢?首先,有许多信号通路对干细胞的分化调控起着重要的作用。
这些信号通路包括Wnt、TGF-beta、Hedgehog、Notch等。
这些通路可以影响干细胞的分化方向、分化速度以及干细胞的自我更新。
例如,Wnt通路可以促进干细胞的自我更新和增殖,并且还可以促进干细胞向神经元和骨骼肌上皮细胞等方向分化。
TGF-beta通路则可以在免疫排斥方面起到重要作用,并促进干细胞向心肌细胞和肺泡基质细胞等方向分化。
Hedgehog通路则可以影响干细胞的增殖和分化,提高胚胎干细胞向肝细胞、胆囊细胞和胰腺细胞等方向分化的潜力。
而Notch通路则可以促进神经元、上皮细胞和免疫系统细胞的分化。
此外,还有一些因素会影响干细胞的分化调控。
例如,干细胞的存储状态、外界环境的变化、疾病的发生等都会影响干细胞的分化调控。
在干细胞存储状态方面,对于一些种类的干细胞来说,存储温度、含氧量以及培养周期等因素都会影响干细胞的分化方向和效率。
在外界环境的变化方面,例如温度、光照等因素的变化也会影响干细胞的分化调控。
而在疾病的发生方面,干细胞的分化调控机制则会受到数目变化等因素的影响。
总的来说,干细胞的分化调控机制是非常重要且复杂的,涉及的因素也非常多。
干细胞的分化调控机制的研究可以为治疗一些疾病提供新的思路和方式。
例如,针对某些疾病,通过控制干细胞分化方向和效率来增加或减少某种类型的细胞数量,从而达到治疗目的。
这种治疗方式目前正在不断的研究和探索中。
细胞分化和干细胞的基本原理细胞是构成生命的基本单位,每个细胞都包含着遗传信息和能够表达这些信息的蛋白质。
但是,不同类型的细胞含有不同的基因表达和功能,并且能够对不同的环境刺激做出不同的响应。
这种细胞的特异性是通过更改基因表达和细胞形态来实现的。
细胞分化是一种过程,该过程使得细胞从未分化的状态逐渐发展成成熟的、功能相对固定的细胞类型。
干细胞是一类可以自我更新和分化成不同细胞类型的细胞,它们在治疗许多疾病中被认为具有潜在的医学应用。
细胞分化是一个复杂而令人着迷的过程,与细胞命运的选择、基因表达的调节以及细胞形态的变化有关。
细胞的分化是一个多阶段的过程,它涉及到基因的转录、翻译和修饰,并且可以被外部因素如细胞因子、信号通路、外界环境和细胞间相互作用影响。
这些影响可以通过改变基因表达来影响细胞的分化方向。
在分化的不同阶段,不同的基因表达模式和细胞形态出现,细胞也逐渐地失去了它们的可塑性,变得更像其它细胞类型。
然而,干细胞是可以自我更新和分化成不同细胞类型的细胞,包括可以分化成神经元、心肌细胞、血液细胞和肌肉细胞等多种类型。
干细胞可以在许多类型的组织和器官中发现,如胚胎、胎儿和成人组织。
在胚胎干细胞中,任何类型的细胞都可以从单个细胞分化出来,这些细胞被称为全能干细胞。
在成人体内,只有一些特定的细胞才具有干细胞特性。
这些细胞被称为多能干细胞,它们可以分化成特定类型的细胞,如血液细胞或骨髓细胞。
在成人体内,外周血液、骨髓、脐带血和胎盘都是常见的含多能干细胞的来源。
干细胞的不同来源具有不同的特点。
胚胎干细胞可以分化为几乎所有的细胞类型,但在进行研究或治疗过程中会涉及到伦理和政治问题。
成人干细胞更适合临床应用,这是因为它们源自成体组织,避免了伦理和道德问题,并且有助于身体自我修复和再生。
另外,由于干细胞的自我更新和分化特性,它们也被广泛地用于疾病的治疗和组织工程中。
细胞分化和干细胞有许多基本原理,包括细胞命运的选择、基因表达的调节和细胞形态的变化。
细胞分化与干细胞细胞分化是指细胞按照其功能和形态的不同,在发育过程中逐渐特化为不同类型的细胞。
而干细胞则具有自我更新和多向分化的特性,可以分化为各种不同类型的成熟细胞。
细胞分化与干细胞研究是生物学领域的重要课题,对于理解生命发展过程和开发治疗方法具有重要意义。
一、细胞分化的过程及机制在多细胞生物的体内,细胞分化是一个复杂而精确的过程。
一般来说,胚胎发育过程中的细胞分化分为三个层次:原始细胞层、间胚层和外胚层。
这些层次的细胞会分化为不同的组织和器官细胞,如神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞等。
细胞分化的机制包括基因调控、细胞与邻近细胞的相互作用和信号传导等。
当细胞分化时,特定的基因会被激活或沉默,调控细胞的形态和功能的发育进程。
细胞间的相互作用和信号传导也能影响细胞分化的方向。
二、干细胞的特点及分类干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,可以在适当的条件下分化为各种不同类型的细胞。
根据来源和分化能力的不同,干细胞可以分为两类:胚胎干细胞和成体干细胞。
1. 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESC)是来源于早期胚胎的细胞,具有较强的分化潜能,可以分化为人体内所有类型的细胞。
由于其分化能力和自我更新能力的特点,胚胎干细胞在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景。
2. 成体干细胞(Adult Stem Cells)存在于成体组织中,具有一定的分化潜能。
成体干细胞主要用于组织修复和再生。
常见的成体干细胞包括造血干细胞、神经干细胞和肌肉干细胞等。
三、干细胞在医学上的应用干细胞具有重要的医学应用价值。
其潜在应用领域主要包括再生医学、基因治疗和药物筛选等。
1. 再生医学:干细胞可以分化为各种特定类型的细胞,因此可以用于组织和器官的再生。
比如,使用胚胎干细胞可以培育出心肌细胞用于心脏组织再生;使用神经干细胞可以帮助修复神经系统损伤。
2. 基因治疗:干细胞可以用于基因治疗,即通过将基因插入干细胞中,进而分化为需要的细胞类型,用于治疗遗传性疾病和其他疾病。
人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究
人脂肪干细胞是从人体脂肪组织中分离得到的未分化多能干细胞,拥有自我复制和多
向分化的潜能。
其具有多种生物学特性,包括:
1.自我更新:脂肪干细胞具有自我更新功能,可以复制更多相同的干细胞,维持其种
群的存在。
2.多向分化:脂肪干细胞可以分化为多种不同的细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等。
3.增殖能力:脂肪干细胞具有较强的增殖能力,可以快速扩增,为后续的细胞治疗提
供足够的细胞数量。
4.成活率高:脂肪干细胞具有高成活率,可以在移植后长期存活并发挥其功能。
除了以上生物学特性,脂肪干细胞的分化研究也是目前生物医学领域的热点之一。
通
过诱导脂肪干细胞分化为特定的细胞类型,可以为组织修复和再生治疗提供新的可能性。
例如,研究发现将脂肪干细胞进行软骨分化后,可以用于治疗关节软骨损伤或疾病。
脂肪干细胞通过向软骨细胞分化并成为新生软骨,为治疗提供了新的选择。
此外,脂肪干
细胞还可以通过向成骨细胞分化,促进骨组织再生和修复。
总之,人脂肪干细胞具有多种生物学特性和分化潜能,其应用在组织修复和再生治疗
等领域具有广阔的前景。
成骨分化(Osteogenesis)是指细胞通过一系列的生物化学和细胞生物学过程,逐渐从未分化的原始状态发展为成熟的骨细胞。
这个过程涉及多个细胞类型,包括干细胞、成骨细胞、软骨细胞等,以及多种细胞因子和信号通路的相互作用。
成骨分化是骨组织生长、修复和再生的重要过程,也是维持骨骼结构和功能的关键因素。
在骨组织形成和修复的过程中,成骨分化主要分为以下几个阶段:
1.干细胞分化:未分化的干细胞通过特定的信号刺激,进入成骨分化途径。
这些干细胞
可以是骨髓间充质干细胞或其他来源的多能干细胞。
2.成骨细胞前体分化:干细胞经过一系列分化步骤,逐渐转化为成骨细胞前体(骨母细
胞或成骨原始细胞)。
这些细胞在骨组织中起到关键作用,调控骨骼的形成和修复。
3.成骨细胞分化:成骨细胞前体分化为成熟的成骨细胞,主要包括成骨细胞和骨小梁表
面的骨吸收细胞。
成骨细胞主要参与骨基质的沉积,使骨骼坚固。
骨吸收细胞则参与骨骼重塑和修复,通过吸收骨基质来维持骨骼的平衡。
4.基质合成:成骨细胞分泌胶原蛋白等骨基质蛋白,逐渐形成骨基质。
骨基质为骨骼提
供了支撑和硬度。
成骨分化受多种调控因子影响,包括细胞因子、生长因子、激素、基因表达等。
这个过程是复杂而精细的,对于骨骼的生长、发育、修复和维持健康至关重要。
干细胞的分化和发育机制研究干细胞是具有自我复制和分化能力的细胞,可以分化成不同类型的细胞。
在生物体的发育过程中,干细胞起着重要作用。
干细胞的分化和发育机制的研究是生命科学领域的热点之一。
干细胞的分化和发育机制包括多个层次的调控。
首先,基因的表达调控是关键。
一个细胞是否表达某个基因,以及表达量的高低,都是细胞分化和发育的决定因素之一。
在细胞内,基因的表达受到DNA甲基化、组蛋白修饰等多种结构和功能上的调控作用。
这些调控作用直接影响基因的转录和翻译,进而影响细胞的生物学特性。
其次,干细胞分化和发育的调控还包括多个信号通路和分子机制。
信号通路负责传递信号并调节细胞的生理状态,决定细胞是否进入分裂、分化或凋亡状态。
干细胞在分化和发育过程中,受到多种信号通路的调控,如Wnt、Notch、BMP和EGF等信号通路。
这些信号通路的激活和抑制直接影响细胞的分化和发育。
同时,一些分子机制如miRNA、转录因子、蛋白质等分子也在细胞分化和发育过程中发挥重要作用。
最后,干细胞分化和发育的调控还受到细胞微环境和外部因素的影响。
细胞微环境包括细胞外基质、激素、细胞间的相互作用等,这些因素直接影响细胞生理和信号通路的调控。
外部因素如温度、氧气浓度、化学物质等也会影响细胞分化和发育过程。
干细胞的分化和发育机制的深入研究,对于生物学的基础研究和临床应用都有重要作用。
在临床领域,干细胞可以用于治疗心脏病、恶性肿瘤等疾病。
同时,对干细胞分化和发育机制的研究,也为干细胞的再生医学和组织工程学等领域提供了理论基础。
在未来的研究中,干细胞分化和发育机制将继续成为重要的研究方向。
同时,为了更好地应用干细胞,我们还需要深入研究细胞微环境和外部因素对干细胞分化和发育的影响,以及相关的信号通路和分子机制。
只有更深入地理解干细胞分化和发育机制,我们才能更好地应用干细胞治疗疾病,并开发出更有效的组织工程学技术。
人类骨髓造血干细胞的分化机制研究骨髓造血干细胞是一类具有自我更新和分化能力的多能干细胞,能产生血液细胞系的各种细胞,如红细胞、白细胞和血小板等。
这种细胞在我们的身体中起着举足轻重的作用。
如果这些细胞不能够正常的产生血液细胞,同样会对人体造成极大的损害,从而诱发一系列血液相关疾病,如血小板过少、贫血等。
因此,对于骨髓造血干细胞的分化机制的研究始终是生物医学界的重点之一。
骨髓造血干细胞分化的基本过程骨髓干细胞分化过程包括自我更新、扩增和分化这三个阶段。
在自我更新过程中,干细胞不断地产生同样具有干细胞特性的新的干细胞,从而使干细胞数量稳定不变。
在扩增阶段中,干细胞经过对分化细胞前体的分裂形成大量的同种或多种不同的祖细胞。
在分化阶段中,分化的干细胞开始向特定的方向分化,并进而变成成熟的血细胞,如红细胞、白细胞和血小板等。
这个过程是受到不同的组织因子的调节。
骨髓生成血细胞的信号通路干细胞在骨髓中要进行自我更新、扩增和分化,需要受到各种雄性激素、细胞因子和细胞外基质的调节作用,这些被称为干细胞分化因子。
其中,SDF-1/CXCR4轴、SCF/c-kit、TPO/MPL轴、IL7/IL7R轴、EPO/EPOR轴、IFNAR-JAK-STAT轴等是比较重要的调节因子。
激活这些信号通路可以刺激造血干细胞的增殖和分化,从而促进血液细胞的生长和发育。
干细胞微环境与造血调控干细胞的微环境是影响骨髓造血干细胞分化的一个关键因素。
微环境中的细胞相互作用、细胞外基质和化学物质等因素对于干细胞分化起着重要的调节作用。
其中,基质细胞调节因子、各种激素、形态学因子和蛋白质分子都可以调节干细胞的增殖和分化。
DNA 甲基化和组蛋白修饰对干细胞分化的作用DNA 甲基化和组蛋白修饰在整个生命过程中都发挥着重要的作用。
在干细胞分化过程中,这些转化过程往往被用来调节基因表达。
研究表明,DNA 甲基化和组蛋白修饰分别在干细胞的自我更新和分化阶段起着不同的作用。
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
干细胞成骨分化和成脂分化后的表征方法及原理YAO Xiang由于易分离获得、免疫原性低且具有多向诱导分化潜能,骨髓基质干细胞(Bone marrow stroma stem cells,MSCs)成为了组织工程与再生医学中理想的种子细胞。
正是由于上述原因,骨髓基质干细胞成为了很多研究者关注并使用的模型细胞。
在我的另一篇百度文献《干细胞诱导分化的方法及各类诱导试剂的配置》中已经详细介绍了骨髓基质干细胞的成骨诱导分化、成软骨诱导分化和成脂诱导分化的参考“诱导方案”及相应诱导试剂的配置和诱导试剂的详细原材料信息。
本文将侧重于介绍骨髓基质干细胞成骨和成脂诱导分化后的表征方法(包括染色表征及利用RT-PCR对相应特征性基于的表达进行表征)及相关原理,这些内容将解答我们怎样快速而有效地表征各个实验组别中成骨和成脂分化的相对强弱。
相关参考内容能够让初步涉入该领域的科研工作者极大地缩短前期探索实验和文献搜索整合所耗费的时间。
本文主要涵盖内容如下:1.成骨分化后的表征方法及原理—染色表征2.成骨分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达3.成脂分化后的表征方法及原理—染色表征4.成脂分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达5.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—染色表征6.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达注:下述各类方案经多次实验验证是行之有效的,笔者依据类似方案发表的部分参考文献如下:1. Yao X, Peng R, Ding JD*. Cell-material interactions revealed via material techniques of surface patterning. Advanced Materials, 2013;25:5257-86. (材料领域TOP期刊)2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. (生物材料领域TOP期刊)3. Yao X, Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction media. Biomaterials, 2013;34:930-9.一、成骨分化后的表征方法及原理—染色表征干细胞成骨分化后会有明显的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,一般也简写为ALP)生成,经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色,未分化细胞则无明显颜色(如后面的图1或图2所示)。
最终可以通过统计各样品中细胞碱性磷酸酶的平均表达强度对其成骨能力进行评估对比。
既可以通过统计各样品中成骨分化细胞的百分比加以表征对比,也可以通过统计ALP染色照片的平均灰度(但需要固定各项拍摄参数)加以表征对比,还有一种方法便是溶解蓝色物质后测吸光度。
图1:干细胞成骨分化后的染色图片示例(ALP和细胞核的复合染色)。
从左到右依次为同一个视野在相差条件、明场条件及荧光条件下的照片记录。
其中染为蓝色的细胞即表明已经发生了成骨分化,而未着色细胞则没有发生成骨分化。
蓝色物质生成原因:碱性磷酸酶将染色液中的α-磷酸萘酚钠(Naphthol AS-MX phosphate alkaline solution)水解,产生α-萘酚与Fast Blue RR偶联形成不溶性蓝色沉淀。
成骨分化后的碱性磷酸酶染色详细步骤参考(含细胞核染色):(1)将一小管固蓝染料(Fast Blue RR,产品编号FBS25 | CAS号14726-29-5 | SIGMA)加入到48 ml Milli-Q水中,磁力搅拌约30 min,使其完全溶解;(2)待固蓝完全溶解后,向溶液中加入2 ml底物(Naphthol AS-MX phosphate alkaline solution,产品编号855 | CAS号1596-56-1 | SIGMA;需在临近染色前加,不可加入太早),继续搅拌5 min;(3)吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液,PBS漂洗3次,每次5 min;(4)加入4%的多聚甲醛,固定15 min;(5)吸去固定液,PBS漂洗3次;(6)加入由步骤(1)和(2)配制好的固蓝染液,染色30 min;(7)吸去染液,PBS漂洗3次,去除残留染液;(8)加入2 μg/ml的DAPI(产品编号D9542 | CAS号28718-90-3 | SIGMA)染液(对细胞核进行荧光染色),染色5 min;(9)PBS漂洗3次,去除残留染液;(10)加入PBS,将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。
干细胞成骨分化后的典型染色照片图1和图2所示。
图2:干细胞成骨分化后的染色图片示例。
此处展示的是一个相对较大视野下的ALP染色结果(明场环境成像),其中染为蓝色的细胞即表明已经发生了成骨分化,而未着色细胞则没有发生成骨分化。
另外,长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐的方式沉淀下来,并形成我们常说的“钙结节”。
因而在评估长时间的成骨诱导时,可选择“钙结节”进行染色。
钙结节的染色方法常用“茜素红”,染色原理就是茜素红和钙发生显色反应,产生一种深红色的化合物,这样成骨诱导细胞外面沉积的钙结节就能被染成深红色。
染色后可以通过着色物的面积和深浅来表征成骨分化的强弱。
具体染色步骤参考如下:(1)吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液,PBS漂洗3次,每次5 min;(2)加入4%的多聚甲醛,固定15-30 min;(3)吸去固定液,加入0.1%的茜素红(品编号A5533 | CAS号130-22-3 | SIGMA-ALDRICH)染色液,染色6-10min;(4)PBS漂洗3次,去除残留染液;(5)加入PBS,将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。
二、成骨分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达干细胞成骨分化后将有明显的成骨细胞特征性基因表达。
如ALP(alkaline phosphatase)、Runx-2(runt related gene Ⅱ)等。
因而可以利用RT-PCR等方法来对相关基于的表达量加以测量,从而对比不同实验组别的成骨分化差异。
在RT-PCR测试中,一般选择的管家基因为GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),有时也称为内参基因,默认它的表达量是相对稳定的。
RT-PCR原理简介:RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)即反转录PCR。
它首先利用反转录过程将RNA(特征基因表达产生的特异信使RNA)变为对应的cDNA,然后通过聚合酶链式扩增反应(PCR)对生成的DNA 加以扩增并测量。
通过测量结果可以反推到RNA表达量的多少,进而反映相关特征基因的表达量。
主要参考步骤如下(本例展示的是对少量细胞样品进行的RNA提取。
当样品中细胞量较大时,建议利用传统的TRIzon Reagent RNA提取试剂来提取RNA,这样可以节省大量成本):(1)干细胞成骨诱导完毕后,依据试剂盒(Promega公司的MagneSil total RNA mini-Isolation System)的标准流程提取每个细胞样本的RNA。
每个样本提取的RNA最终溶解在50 μl 水中(RNase-free,试剂盒自带),提取完毕后可将样本置于-80℃冰箱中保存备用;(2)利用ThermoFisher Scientific公司的NanoDrop 2000对提取RNA的浓度进行检测,每次用样1 μl;(3)每样本量取15 ng前述提取的RNA,然后利用TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒在20 μl体系中对RNA进行反转录,合成后续实验所需的cDNA;(4)依据标准实验流程,在20 μl体系中,利用预先设计好的引物(见Table 2.1)在Qiagen公司的Rotor Gene Q System进行定量PCR实验,选用的试剂盒为Qiagen公司的Rotor-GeneTM SYBR® Green PCR Kit。
(5)对实验数据采用2-△△Ct的方法加以分析处理,实验中选择的管家基因为GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),最终实验数据选择一个参照组别进行归一化处理。
Table 2.1. RT-PCR primer sequences of the osteogenic marker genes.(此处设计的引物序列适合SD大鼠种属,适宜人类的引物可参考大量文献报道)Runx-2GATTACAGA TCCCAGGCAGAC CAGAGGCAGAAGTCAGAGGTALP ATGGTAACGGGCCTGGCTACA AGTTCTGCTCATGGACGCCGTGAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAG TGGTAACCAGGCGTCCGAT三、成脂分化后的表征方法及原理—染色表征在干细胞的成脂诱导中,成脂后细胞的胞浆中将会有油滴(也称为脂肪滴)的产生和积累,随着时间的延长将不断增多变大。
因而可以考虑通过利用Oil Red O(油红)试剂将油滴标记为红色来加以表征。
干细胞成脂分化后会有明显的脂肪滴产生,经油红染色后在显微镜下呈现显著的红色,未分化细胞则无明显颜色,典型照片如图3所示。
最终可以通过统计各样品中成脂分化细胞的百分比来对成脂分化强弱加以表征对比。
图3:干细胞成脂分化后的染色图片示例(脂肪滴和细胞核的复合染色结果)。
从左到右依次为同一个视野在相差条件、明场条件及荧光条件的照片记录。
其中染为红色的细胞即表明已经发生了成脂分化,而未着色细胞则没有发生成脂分化。
红色物质生成原因:Oil Red O是一种亮红色的油溶性染料,这里主要利用的便是该试剂的油溶性,进而对细胞内的脂肪滴(油滴)有较强的着色力,而对其它的细胞结构着色性差。
具体染色参考步骤如下(含细胞核的荧光染色):(1)吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液,PBS漂洗3次,每次5 min;(2)加入4%的多聚甲醛,固定15 min;(3)吸去固定液,PBS漂洗3次,每次5 min;(4)加入60%的异丙醇,漂洗样本30 s后立即吸弃;(5)加入油红O染液(产品编号O0625 | CAS号1320-06-5 | SIGMA-ALDRICH)(30 mg/ml,用60%的异丙醇配置),染色15 min;(6)吸去染液,PBS漂洗3次,去除残留染液;(7)加入2 μg/ml的DAPI染液(对细胞核进行荧光染色),染色5 min;(8)PBS漂洗3次,去除残留染液;(9)加入PBS,将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。