干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法

中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。

通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

骨髓间质干细胞成软骨诱导分化实验原理
软骨的破坏、缺失是包括骨关节炎（osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。

由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。

近年来，随着间充质干细胞的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。

MSC成软骨分化的过程：MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。

体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Westernblot检测II型胶原蛋白的表达和RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达，不同的角度进行鉴定；而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。

下图是骨髓间充质干细胞的成软骨分化诱导图，可以看到软骨细胞埋藏在软骨间质内，它所存在的部位为一小腔，称为软骨陷窝（cartilage lacuna）。

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究毛丽霞;刘加强;赵晶蕾;王洁;夏韫晖;王博;袁玲君;房兵【摘要】目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。

方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD34、 CD44、CD45、 CD90、 CD105的表达。

体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化，通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况，通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达，未成骨诱导细胞作为对照。

结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、 CD29、 CD44、 CD90、 CD105，阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。

成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性，21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成，对照组为阴性。

成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达，OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。

结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化，形成钙盐沉积和矿化结节， ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。

%Objective:To investigate the capability of human dental pulp stem cells (hDPSCs) on osteogenic differentia-tion in vitro.Methods:hDPSCs were purified by magnetic-activated cell sorting with Stro-1 and the phenotypes were ana-lyzed with stem cell surface markers CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1,CD34, CD45. hDPSCs were treated continuous-ly with osteogenic inductive medium for 21. Alkaline phosphatase(ALP) staining, the expression levelsof ALP, osteocalcin (OC), Collengen I(ColI), RunX2 genes and alizarin red staining for mineralization at different time points were analyzed. The non-induced cells were used as control.Results:Phenotype analysis indicatedthat hDPSCs were positive for mes-enchyme stem cell markers CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1, and negative for hematopoietic stem cell markers CD34, CD45. Compared with the control group, the ALP staining of the cells in induced group were significantly higher at day 5, 7, 14 and only the induced cells could form mineralized nodes as shown by alizarin red staining on Day 21. The expression of the ALP, ColI, RunX2, OC genes were positive in induced group.Conclusion:Human DPSCs selected by Stro-1 have the potential of differentiation into osteoblasts under osteogenic culture and forming mineralized nodes. Osteoblast markers (ALP, OC, ColI, RunX2 etc) participated in the osteogenic differentiation of hDPSCs.【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P193-198)【关键词】人牙髓;干细胞;成骨诱导;细胞分化【作者】毛丽霞;刘加强;赵晶蕾;王洁;夏韫晖;王博;袁玲君;房兵【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科上海 200011【正文语种】中文【中图分类】R782.4人牙髓干细胞(human dental pu lp stem cell，hDPSCs)具有自我更新和多向分化潜能[1,2]，可向多种细胞分化，其中包括成骨样细胞[3-5]，这种特性使人牙髓干细胞替代骨髓基质干细胞修复骨组织缺损成为可能。

茜素红染色成骨分化是干细胞的一个重要特性。

在特定的诱导培养基作用一段时间后，干细胞可分化为成骨细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。

应用茜素红的复合物，可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞转化一．实验目的：通过茜素红染色检测细胞成骨分化二．实验原理：1.成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，即“钙结节”，鉴定钙结节的染色方法常用茜素红染色法。

2.茜素红：茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。

橙黄色或黄棕色粉末。

易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。

1%水溶液pH为2.15，其水溶液呈前黄褐色，加盐酸后变为黄色，加氢氧化钠后则变成蓝紫色。

有刺激性。

能与许多金属离子生成有色化合物，能与锆、钍、铝、钛及钙发生显色反应。

3.染色原理：茜素红与钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。

三．实验试剂及仪器1.试剂：PBS 10%甲醛缓冲液0.1%茜素红-Tris-HCL染液蒸馏水2.仪器：倒置显微镜四．实验步骤1.弃培养液，PBS冲洗2次2.10%甲醛缓冲液固定10min3.蒸馏水冲洗3次4.加入0.1%茜素红-Tris-HCL染液（pH8.3）,37℃下染色30min5.蒸馏水冲洗6.在倒置显微镜下观察有无茜素红染色阳性细胞五．实验结果及讨论RT-PCR检测PPARγmRNA表达水平实验目的：定量检测干细胞中PPARγmRNA的表达水平实验原理：1.由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

2.RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。

间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。

间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。

本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。

一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。

成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。

因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。

1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。

因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。

此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。

2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。

这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。

确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。

3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。

包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。

1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。

这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。

2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。

三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。

完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质)转化生长因子β1 10ng/ml,（左旋）维生素C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。

倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。

细胞长成单层后进行传代。

细胞培养3周。

去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min ,麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。

诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养: 取第3代细胞, 接种入含体积分数为0.1 的新生牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。

间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14 d 的细胞, 40 g/L 中性甲醛固定15 min, Gomori改良钙钴法染色。

取5 块玻片, 每片随机取2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。

:取第3 代细胞, 以1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导3, 5, 7, 10, 12,14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。

人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。

与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。

因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。

本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。

人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。

提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。

在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。

手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。

提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。

2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。

通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。

细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。

培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。

3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。

常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。

油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。

人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。

为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。

1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。