海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用

基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第444丨-4448页研究报告Research Report花鲈7Y7?基因表达和功能分析庞微1赵紫维1申亚伟1李军2,3陈晓武4,5#1上海海洋大学,水产科学国家级实验科教示范中心，上海,201306; 2中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室，青岛，266071; 3青 岛海洋科学与技术国家实验室，海洋生物学与生物技术功能实验室，青岛，266237; 4上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海，201306; 5上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,上海，201306* 通信作者，***************.cn摘要花鲈是中国重要的海水鱼，它可以在河口或淡水中生长。

体色是鱼类重要的 生物学特征，与鱼或鱼肉的外观有密切关系，影响其市场价值。

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是黑色素合成的关 键酶。

本研宄克隆了花鲈基因，其包括完整开放阅读框1 620bp,编码539个氨基酸，分子量为61.1 kD,理 论等电点为6.04。

花鲈T Y R有丨9个氨基酸编码的信号肽，一个跨膜结构域。

花鲈基因还含有2个保守 的结构域:EGF-Iike结构域和铜离子结合区域，还有6个保守的组氨酸位点。

系统进化分析表明花鲈7Y/?与 大黄鱼(LaHmic/u/tys有着较高的同源性，物种间亲缘关系与其传统分类地位一致。

蛋白质结构预测也表明花鲈T Y R的三维结构具有典型的酪氨酸酶特征，包括酪氨酸结构域和铜离子结合的氨基酸位点。

PCR 结果显示花鲈7Y/?主要在鳃、脾、皮肤、胃盲囊、中肾、头肾和伪鳃中表达。

在胚胎期发育中，7T/?从原肠期开 始表达。

本研宄结果说明花鲈7Y7?不仅和黑色素的合成有关，也可能参与其它生理活动以及花鲈早期胚胎 发育，为进一步研究鱼类7Y/?的功能和进化提供理论依据。

关键词花鲈,717?基因，序列分析，蛋白质结构Expression and Function Analysis of TYR from Lateolabrax maculatusPang Wei 1Zhao Ziwei 1Shen Yawei 1Li Jun23Chen Xiaowu4,5*1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306; 2 CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, 266071; 3 Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, 266237; 4 Shanghai Engineering Research Center of Aqua­culture, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306; 5 Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai O- cean University, Shanghai, 201306*Correspondingauthor,***************.cnDOI: 10.13417/j.gab.039.004441Abstract L a teo la b ra x maculatus is an important marine fish in China.It can grow in estuary and fresh water. Body color is an important biological feature of fish,it is also closely related to the appearance of live fish or fish meat product,and affected its market value.Tyrosinase (TYR)is the key enzyme in melanin synthesis.The L. maculatus TYR (Lm-TYR)gene was cloned and analyzed in this study.The gene includes 1 620 bp open reading frame,coding539 amino acid.The protein has a predicted molecular mass of61.1 kD and theoretical isoelectric point is6.04. Lm-TYR has a 19 amino acids putative signal peptide at the N terminal and a transmembrane region at the C-terminal end.The Lm-TYR gene family contains two conserved domain:EGF-like domain and copper ion binding domain.The protein has6 conserved histamine sites.Phylogenetic analysis showed that the Lm-TYR gene基金项目：本研究由现代农业产业技术体系专项资金资助项目(CARS-47)和中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验 室幵放课题(No. KF2017NO2)共同资助引用格式：Pang W.，Zhao Z.W., Shen Y.W., Li J., and Chen X.W., 2020, Expression and function analysis of 7T7? frommac"/ato, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39(10): 4441-4448 (庞澂，赵紫维，申亚伟，李军，陈晓武，2020,花鲈7T/?基因表达和功能分析，基因组学与应用生物学，39(10): 4441-4448)4442 基因组学与应用生物学was classified to a subfamily of teleost with high homology with Larimichthys crocea.The genetic relationship between species is consistent with their traditional taxonomic status.Protein structure prediction indicated that the three-dimensional structure of gastric caecum has typical TYR protein characteristics,including tyrosine domain and two copper ion-binding sites.RT-PCR showed that Lm-TYR was mainly expressed in gill,spleen,skin,gastric caecum,kidney,head kidney and pseudobranch.During embryonic development,Lm-T}R gene is expressed from the gastrula stage.The results showed that the tyrosinase was not only involved in the synthesis of melanin,but also involved in other physiological activities and early embryonic development.This paper lays a foundation for further research on the function of fish TYRs.Keywords Lateolabrdx rmicuhuus,Tyrosinase,Sequence analysis,Protein structure鱼体色由色素细胞存在的数量、性质以及分布决 定，黑色素细胞是最常见和最保守的一类。

2021年第2期海洋开发与管理69小球藻属DNA条形码的鉴定研究张稚兰】，邢炳鹏12(1.自然资源部第三海洋研究所厦门361005,2.自然资源部北部湾滨海湿地生态系统野外科学观测研究站北海536015)摘要：为探讨小球藻鉴定的新方法以及评估小球藻属DNA条形码候选序列的鉴定作用，文章对20株小球藻的线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基I(COI)、核基因组rDNA的内转录间隔区(ITS)以及核酮糖1,5-二磷酸竣化酶(rbcL)3个片段进行PCR扩增测序，并对各序列进行生物信息学分析。

研究结果表明：COI、ITS和rbcL序列在20株小球藻中的扩增和测序效率均呈阳性,扩增成功率分别为76%、83%和70%；经评估，COI、ITS和rbcL序列作为DNA条形码在小球藻分类鉴定中均不适合较低的分类单位，但可参考动植物的分类方法，将多个片段组合应用，从而筛选不同进化级别的DNA条形码。

关键词：小球藻；DNA条形码；分类鉴定；物种；基因中图分类号：Q919.21文献标志码：A文章编号：1005—9857(2021)02—0069—08Assessment of Candidate DNA Sequencesfor Barcoding of the Genus ChlorellaZHANG Zhilan1,XING Bingpeng12(1.Third Institute of Oceanography,MNR,Xiamen361005,China;2.Observation and Research Station of Coastal Wetland Ecosystem in Bcibu Gulf MNR,Bcihai536015,China)Abstract：To evaluate the validation of DNA barcoding candidate sequence in identifying Chlorella?to discuss the new ways of identifying,this paper took20individuals sampled for analy­sis?3sequences cytochrome coxidase I(COI)?internal transcribed spacer(ITS)and ribulose-1, 5-bisphosphat.e of carboxylase(rbcL)were amplified and sequenced.These sequences were ana­lyzed by bioinformatics methods.The result,showed both amplifying and sequencing effects of COI9ITS and rbcL towards the sample of chlorella were positive,he amplification success rate was76%,3%and70%,these3sequences were not.suitable for lower taxa level.【n the future the combination of many segments could be considered and tested,o pick out.the different,evolution­ary levels of DNA barcoding.Keywords:Chlorella?DNA barcoding,Identification,Species,Gene收稿日期：2020-03-23；修订日期：2021-01-08基金项目：自然资源部第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目（海三科2015012、海三科2019015）.作者简介：张稚兰，助理研究员，硕士，研究方向为海洋生物多样性通信作者：邢炳鹏，助理研究员，硕士，研究方向为海洋生物多样性70海洋开发与管理2021年0引言小球藻(Chlorella)是球形单细胞真核微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta),是地球上最早出现的生命之一。

国家高技术研究发展计划（863计划）现代农业技术领域“海水养殖种子工程”重大项目课题申请指南一、指南说明海水养殖种子工程包括海水养殖优良种质创制和健康苗种繁育两个部分，是发展海水养殖业的重要物质基础，也是海洋农业技术领域国际竞争的焦点。

加快育种核心前沿技术的研究，培育优良品种，实现名贵海水养殖生物苗种的规模繁育，对发展“高产、优质、抗逆、生态、安全”的海水养殖业，提升海洋农业科技核心创新能力和国际竞争力，促进我国向现代海洋农业强国转变具有重要意义。

本项目以“十五”期间863计划、973计划等在海水养殖种子工程方面取得的研究成果和建成的基地为基础，应用分子标记辅助育种技术，结合传统杂交和选育等技术，系统开展鱼类、虾蟹类、贝类、海参和藻类等的遗传改良研究，创制一批新种质材料；定位一批与重要生产性状相关的QTLs，构建分子育种技术体系；提升细胞工程育种技术、重要生产性状基因的发掘与应用技术、分子育种技术和鱼虾性别控制技术的水平，培植技术源头创新能力；开展生殖调控技术、优质亲体和苗种培育技术及优良品种的快速繁育技术等的研发。

此次发布的是现代农业技术领域“海水养殖种子工程”重大项目课题申请指南，拟支持16个研究课题，包括：（1）重要海水养殖动物细胞工程育种技术；（2）重要生产性状关键基因的发掘与应用技术；（3）鱼、虾等性别控制技术；（4）鲆鲽类高产、抗逆品种的培育；（5）大黄鱼等优质、抗逆品种的培育；（6）虾、蟹高产、抗病品种的培育；（7）鲍高产、抗逆品种的培育；（8）扇贝高产、抗逆品种的培育；（9）珍珠贝和牡蛎优质、高产、抗逆品种的培育；（10）蛤、蚶、蛏等高产、抗逆品种的培育；（11）刺参、海胆等高产、抗逆品种的培育；（12）海带、裙带菜等优质、高产、抗逆品种的培育；（13）紫菜、江篱等优质、高产、抗逆品种的培育；（14）名贵鱼类苗种规模繁育技术；（15）大珠母贝、江珧等苗种规模繁育技术；（16）羊栖菜等苗种规模繁育技术。

海水鱼鱼病症状与治疗首先谈谈鱼类致病因子一.环境因子: 1.水质不良,(NH3,NO2过高它能影响红血球失去运输氧的能力，和伤害生物的器官,在海水系统当中因为cl离子会比no2离子更容易被鱼吸收,所以no2毒性比淡水低很多,而NH3氨有剧毒，NH4铵毒性轻微。

两者的相对含量，与水的pH有关。

pH每上升1.0，NH3的含量升十倍。

Ph7时有99.7%NH4，0.3% NH3；pH8.4时有84.7% NH4，15.3% NH3所以海水系统中氨毒性比淡水中性或酸性水高很多,很多人都测试no2浓度其实是养淡水的观念,海水系统不适用。

有机氮废物高会成为寄生虫与病原菌的温床,如残饵,粪便,底砂中的污泥.在此稍做说明一下,原虫一般附着在沙子,缸壁，塑料上生活，捕食生存于水中的多种微生物（细菌类），这是牠通常的生息型态,寄生于鱼的表皮部分则是变异形生息型态,鱼的皮肤上会产生炎症，而随着虫体数的增加，皮肤组织逐渐遭到侵蚀破坏，而露出肌肉,除此之外，还会间接地受到细菌类的感染,水温高时，繁殖会很旺盛，形成的幼虫会分裂游泳，而传染至其它的鱼体上小擦伤或锚虫刺伤的不处理，如果未分泌表皮黏液，很容易感染以大肠菌为首的各种细菌，同时迅速地繁殖起来。

这些地方成为原生动物类绝佳的采食场所。

在种种的资料显示,有机氮废物高的水体,非常容易大量繁殖寄生虫造成严重感染,所以水质的优良与否不应该只是测量无机氮废物NH3或NO2来断定,而是有机氮废物的含量也须处理,处理的方式分两个方面,高效率的蛋白除沫机可以处理微细的有机氮废物,不使用抽底砂系统,而在底缸或其它过滤加一道细白棉前置过滤隔除较大形的有机氮废物,常常清理这道白棉可有效控制有机氮废物的含量) 2.不适合的水温,ph,比重...过高或过低都不宜 3.其它有毒物质,如重金属污染(根据水试所的研究,铜离子会抑制酵素系统,降低免疫力,很容易造成孤菌感染),或其它有毒物质如杀虫剂,硫化氢H2S. 4.溶氧过低,造成鱼类生理代谢的影响... 二.病原: 细菌、病毒、霉菌和寄生虫。

鱼类增养殖学复习题一、名词解释1.养殖和增殖养殖：指将鱼放入水体中并加以适当管理，使其生长、繁殖，长大上市。

增殖：指在渔业水域，直接或间接地对水生生物及其栖息环境进行管理，恢复、维持和增加渔业资源数量所采取的各种措施。

rva和juvenileLarva（仔鱼期）：指刚从卵膜孵出，卵黄囊较大，眼无色素，身体具鳍褶的仔鱼。

Juvenile（稚鱼期）：指鳍褶完全消失，体侧开始出现鳞片至全身被鳞的稚鱼。

3.鱼苗和鱼种鱼苗：系指孵化脱膜后的仔鱼和稚鱼的统称；鱼种：指供池塘、水库、河沟等水体放养，以养成食用鱼的幼鱼。

4.鱼苗培育和鱼种培育鱼苗培育：指将鱼苗经15～20d的饲养，培育成全长3cm左右的稚鱼。

鱼种培育：指将夏花分塘继续饲养2～5个月，使其长成全长10～20cm的幼鱼。

5.轮养和套养轮养：又称轮捕轮放，是将多种且多规格的鱼类混养在同一池塘中，分次捕捞达到食用规格的个体并补放适量鱼种的养殖方式。

套养：指同一种或不同种鱼类不同规格的鱼种同池混养。

6.单养和混养单养：单一品种鱼苗的培养或单一品种相同规格的鱼种的养成。

混养：指不同种类或同种不同规格的养殖对象同塘饲养的养殖方式。

7.浮头和泛池浮头：鱼类因水中缺氧而浮到水面的现象。

泛池：大批鱼类因缺氧而窒息死亡的现象。

8.整塘与清塘整塘：是将池水排干，挖出过量的淤泥，整平池底，修好池堤和进、排水口，填好漏洞裂缝，加固堤埂，疏通注排水渠道，清除杂草和砖石等。

清塘：是在池塘内施用药物杀灭影响鱼苗生存、生长的各种生物，以保障鱼苗不受敌害、病害的侵袭。

9.绝对繁殖力和相对繁殖力个体绝对繁殖力指一尾雌鱼在繁殖季节前卵巢中所怀的成熟卵粒数。

个体相对繁殖力指一尾雌鱼在一个生殖季节中，单位体重或单位体长所具有的平均怀卵量。

10.繁殖次数和产卵次数繁殖次数：指一生中进行繁殖的次数。

产卵次数：指一个繁殖期内产卵的次数。

11.排卵和产卵排卵：指成熟卵母细胞从滤泡中脱离出来到卵巢腔成为游离的成熟卵子的过程。

石斑鱼病毒性神经坏死病的病原分离和鉴定LIN Nan;WU Bin;LI Miaomiao;WANG Qiaohuang;LIN Guoqing;FAN Haiping;LIN Kebing【摘要】对福建省漳州市某水产养殖场发生的疑似病毒性神经坏死病的病鱼进行病原分离和鉴定.从出现疑似病毒性神经坏死病症状的石斑鱼苗上取眼部、脑部组织进行研磨,将匀浆液接种到条纹月鳢细胞系(SSN)细胞株SSN-1及其克隆细胞株E-11,两株细胞均出现明显的细胞病变,细胞肿胀变圆,呈空泡化并脱落,E-11细胞较SSN-1细胞更早出现细胞病变,且病变更明显.将病鱼眼部、脑部组织的研磨液、细胞培养上清进行RT-PCR检测,均检测出病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的特异性条带,目的片段大小为427 bp,序列比对结果提示该病原为赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV).电镜观察结果显示,细胞培养上清中存在直径约30 nm的病毒颗粒,细胞质内大量病毒颗粒聚集成团,细胞器受损,细胞结构被破坏.将分离得到的VNNV进行温度、酸碱度敏感性试验,结果显示:50℃下处理30 min后该病毒滴度明显下降,60℃处理30 min后病毒失活;在pH为3、11的条件下病毒滴度均明显下降.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(048)004【总页数】6页(P474-479)【关键词】石斑鱼;病毒性神经坏死病;分离;鉴定【作者】LIN Nan;WU Bin;LI Miaomiao;WANG Qiaohuang;LIN Guoqing;FAN Haiping;LIN Kebing【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S943石斑鱼属硬骨鱼纲鲈形目鮨科，其肉质鲜美，体色斑斓，是我国南方沿海水产养殖的重要品种.目前发现石斑鱼感染的病毒病主要有病毒性神经坏死病、传染性胰腺坏死病、虹彩病毒病等[1].病毒性神经坏死病又称病毒性脑病、视网膜病，病原为病毒性神经坏死病病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV)，该病原主要感染海水鱼苗，感染特征为中枢神经组织、视网膜组织出现空泡化，病鱼表现出不同程度的神经异常症状[2]，我国在2001年首次发现此病[3]，随后国内学者从不同角度对此病进行了研究[4-7].2008年，蒋方军等[8]利用条纹月鳢(striped snakehead, SSN)细胞株SSN-1对VNNV进行了病毒分离、鉴定、部分特性研究.E-11细胞是Iwamoto et al[9]利用SSN-1细胞系克隆出的细胞株，E-11细胞比SSN-1细胞能更快更稳定地生长，并且在VNNV感染后表现出更明显的细胞病变.但国内至今还未见利用E-11细胞分离石斑鱼VNNV的报道.目前石斑鱼病毒性神经坏死病仍未有有效的治疗方法，因此，利用有效的细胞系分离纯化病毒，研究病毒理化特性显得尤为重要.本试验采用SSN-1细胞株及其克隆细胞株E-11对从福建省漳州市采集到的疑似病毒性神经坏死病的石斑鱼苗进行病原分离和鉴定，并对分离的病毒株进行了温度、酸碱度敏感性试验，旨在为病毒性神经坏死病的防控及相关研究提供参考.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞 SSN-1细胞由深圳海关动植物检验检疫技术中心提供；E-11细胞由福建省水产研究所提供.1.1.2 试剂 RNA样品保存液、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR预混试剂盒购自TaKaRa公司；L-15培养液、胎牛血清购自HyClone公司；戊二醛电镜固定液购自武汉赛维尔公司；磷钨酸负染色液(3%)购自上海晶都生物公司.1.1.3 仪器与设备主要仪器与设备有GBOX-F3凝胶成像仪(英国Syngene公司)、HT7700透射电镜(日本日立公司)、UC7超薄切片机(德国徕卡公司).1.2 病鱼材料的提取从福建省漳州市某水产养殖场收集疑似患病毒性神经坏死病的珍珠龙胆石斑鱼苗(体长2～5 cm)100尾，提取眼部、脑部组织各2份：一份低温保存在RNA样品保存液中，待研磨后用于RT-PCR的检测；一份置-20 ℃下保存，待研磨后用于病毒分离.1.3 细胞培养SSN-1、E-11细胞分别在含20% 胎牛血清的L-15培养液(27 ℃)中培养，细胞经胰蛋白酶消化传代，培养至汇合度达90%以上时使用.1.4 病毒分离1.4.1 病鱼材料的处理在病鱼材料中加入适量1×PBS，充分研磨后于5 000 r·min-1离心10 min，取上清，按1∶10的比例加入含双抗(1 000 IU·mL-1青霉素、1 000 μg·mL-1链霉素)的L-15培养液，于4 ℃下过夜，经0.45 μm滤器过滤后，用含胎牛血清的L-15培养液作10、102、103、104倍稀释.准备培养至汇合度达90%的SSN-1、E-11细胞，吸出培养液.将以上各稀释度的病毒液、空白对照液(仅培养液)分别加入到细胞孔中，于培养箱(27 ℃)中吸附2 h，补加含胎牛血清的L-15培养液，放入培养箱(27 ℃)中培养，逐日观察、记录细胞的变化. 1.4.2 细胞悬液的收集待细胞出现病变时，冻融一次，收集细胞悬液，于2 000 r·min-1离心3 min，取上清继续接种细胞并观察细胞的病变情况.1.5 RT-PCR鉴定1.5.1 引物合成石斑鱼病毒性神经坏死病病原检测引物参考GB/T 27531—2011[10]的方法合成，扩增的目标基因为：赤点石斑鱼VNNVRNA-2片段完整序列.引物序列为：F—5′-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3′；R：—5′-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.1.5.2 病毒核酸的提取病鱼材料用适量的1×PBS洗去残留的RNA样品保存液，充分研磨后，于5 000 r·min-1离心10 min，取上清备用.待检病鱼材料上清和上述细胞培养上清样品的病毒RNA参照Viral RNA/DNA Extraction Kit试剂盒说明书的步骤提取.1.5.3 RT-PCR鉴定 RNA反转录参照PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书的方法进行.在PCR管中分别加入2 μL 10 mmol·L-1引物、4 μL模板、25 μL Premix Taq预混试剂、17 μL DEPC水，混匀后稍离心.PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保温.1.5.4 产物检测用TAE缓冲液配制含GelRed染料的1.0%琼脂糖凝胶，PCR产物于100 V恒压凝胶电泳，然后置凝胶成像仪下观察、拍照.产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序.1.5.5 序列比对及系统树的构建从NCBI公共数据库上查找病毒性神经坏死病4种基因型及诺达病毒科其他种属相关基因的序列(表1).采用BLAST比对样品测得序列和已知病毒株序列，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树.表1 用于构建系统发育树的病毒株及其NCBI登录号Table 1 Virus and accession numbers of gene sequences for molecular phylogenetic analysis 病毒登录号目标基因罗氏沼虾诺达病毒 NC_005095RNA2片段完整序列凡纳滨对虾诺达病毒 NC_014977RNA2片段完整序列野田村病毒NC_002691RNA2片段完整序列布拉拉罗病毒 NC_004145RNA2片段完整序列羊舍病毒 NC_004144RNA2片段完整序列拟鰺神经坏死病毒NC_003449RNA2片段完整序列红鳍东方鲀神经坏死病毒NC_013461RNA2片段完整序列条斑星鲽神经坏死病毒 NC_013459RNA2片段完整序列赤点石斑神经坏死病毒 NC_008041RNA2片段完整序列1.6 电镜观察1.6.1 病毒颗粒负染观察将感染病毒后的细胞培养上清于12 000 r·min-1离心40 min，取上清置3 ku超滤离心管中，于7 000 r·min-1离心40 min，弃去滤下液，加入等体积的ddH2O稀释浓缩液，于7 000 r·min-1离心40 min，收集浓缩液. 将上述收集液滴在铜网上3 min蘸取样品，用滤纸吸干多余液体，再将2%磷钨酸染色液滴在铜网上染色3 min，用滤纸吸干多余液体，电镜观察.1.6.2 细胞超薄切片的观察吹打使感染病毒3 d的E-11细胞脱落，吸出培养液加入电镜固定液于4 ℃固定2 h，于300 r·m in-1低速离心细胞至管底，用1%琼脂糖包裹，洗涤.用1%锇酸室温固定2 h后洗涤.用乙醇和丙酮脱水，包埋，超薄切片机切片成60～80 nm的厚度，铀铅双染色，切片置室温下干燥过夜，电镜观察.1.7 病毒特性分析1.7.1 病毒滴度的测定取铺满单层E-11细胞的96孔板，弃去培养液，将病毒上清连续10倍稀释至10-10，各稀释度8个复孔，接种至96孔板中，每孔100 μL，设立空白对照，于27 ℃吸附2 h，补加L-15培养液至每孔200 μL，于27 ℃下培养，每日观察细胞变化并记录细胞病变的情况，7 d后采用Reed-Muench法[11]计算病毒的半数组织细胞感染量(TCID50).1.7.2 温度敏感性试验取适量病毒上清，分别置30、40、50、60 ℃下处理30 min，设立空白对照，按照上述病毒滴度测定方法计算其TCID50.1.7.3 酸碱度敏感性试验配制0.1 mol·L-1 HCl、0.1 mol·L-1 NaOH，取适量病毒上清，分为2份，分别用HCl、NaOH调整pH至3、11，置27 ℃下处理30min，设立空白对照，按照上述病毒滴度测定方法计算其TCID50.2 结果与分析2.1 发病鱼的临床症状发病石斑鱼摄食量下降，浮于水面或趴底侧躺，体色发黑，有的呈螺旋状打转，有的出现发癫症状，部分鱼死亡时嘴大张，表现出不同程度的神经异常.2.2 病毒的细胞分离在27 ℃培养条件下，SSN-1、E-11细胞接种病料悬液后第3天开始出现细胞病变，第4天两株细胞的病变形态如图1A、1C所示.图1A、1C显示，细胞肿胀浑圆，呈颗粒状并出现空泡化，最后大批细胞溶解脱落.E-11细胞较SSN-1细胞更早出现病变，且病变更明显.SSN-1、E-11细胞空白对照形态正常(图1B、1D). A：感染VNNV的SSN-1细胞；B：SSN-1细胞的空白对照；C：感染VNNV的E-11细胞；D：E-11细胞的空白对照.图1 SSN-1、E-11细胞感染VNNV后出现的病变形态Fig.1 Cytopathic effect of SSN-1 cell and infected E-11 cells 2.3 病毒的RT-PCR鉴定M：DL2000 DNA Marker；1：空白对照；2：病鱼材料的研磨样品；3：感染VNNV的SSN-1细胞上清样品；4：感染VNNV的E-11细胞上清样品.图2 RT-PCR鉴定结果Fig.2 RT-PCR identification of the sample病鱼样品RT-PCR检测电泳结果(图2)显示，病料研磨样品及SSN-1、E-11细胞培养上清样品均出现特异性条带，目的片段大小约427 bp.扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果经序列比对分析显示，3份样品基因序列的相似性达100%.构建的系统发育树(图3)显示，本试验分离到的病毒株与赤点石斑鱼神经坏死病毒(redspotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)的亲缘关系最近，鉴定该病毒为RGNNV.2.4 病毒的电镜观察病毒液浓缩后经磷钨酸负染色，干燥后置电镜观察，可见粒径为25～35 nm、近二十面体的VNNV颗粒(图4A).将感染VNNV 3 d的E-11细胞制成超薄切片后置电镜下观察，可见细胞质内大量病毒颗粒聚集成团，细胞膜结构被破坏，细胞器受损，细胞质出现大量空泡，但细胞核结构完整(图4B、4C).图3 分离到的VNNV系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of VNNVA：负染后的VNNV病毒颗粒(箭头示病毒颗粒，25 000×)；B：病毒感染后的E-11细胞切片(箭头示病毒颗粒，10 000×)；C：E-11细胞质出现大量空泡(2500×).图4 VNNV的电镜观察结果Fig.4 Electron micrograph of VNNV2.5 病毒滴度接种VNNV的E-11细胞置27 ℃下培养，每日观察并记录细胞的变化，7 d后病毒的滴度达105.07 TCID50·mL-1.2.6 病毒的温度敏感性接种细胞前将VNNV病毒液分别置30、40、50、60 ℃处理30 min后，每毫升VNNV病毒液的TCID50分别为104.63、104.30、103.30、0，空白对照组为105.07.结果显示，50 ℃下处理30 min后病毒滴度明显下降，60 ℃处理30 min 后病毒失活.2.7 病毒的酸碱度敏感性将VNNV病毒液的pH分别调节至3、11，置27 ℃处理30 min后，每毫升VNNV病毒液的TCID50分别为102.89、102.08，空白对照组为105.45.结果显示，在pH为3、11的条件下，本试验分离的VNNV滴度均明显下降.3 讨论病毒性神经坏死病是世界范围内海水鱼类最常见、危害最严重的传染病之一，除石斑鱼外，牙鲆、鲈、东方鲀、军曹鱼等品种均有感染病毒性神经坏死病的报道[12].1991年Mori et al[13]根据柯克原则确定病毒性神经坏死病是由鱼类VNNV引起的.根据病毒颗粒衣壳蛋白基因的不同序列，将VNNV分成4个基因型，即RGNNV、红鳍东方鲀神经坏死病毒、条斑星鲽神经坏死病毒、黄带拟鲹神经坏死病毒(striped jack nervous necrosis virus, SJNNV)[14].不同基因型产生细胞病变所需的温度、时间不一样，且细胞病变形态也不同.福建闽南地区感染石斑鱼的神经坏死病毒主要为RGNNV基因型[15].本试验对福建省漳州市某水产养殖场发生的疑似石斑鱼病毒性神经坏死病进行了病原分离和鉴定，结果显示该病原为VNNV，基因型为RGNNV，下一步计划对该株VNNV进行全基因组测序，进一步分析其病原学特征.目前能用于VNNV培养的细胞主要有SSN-1[16]、E-11[9]、石斑鱼鳍细胞系(GF-1)[17]、石斑鱼脑细胞系(GB)[18]、石斑鱼脾细胞系(GS)[19]等细胞.E-11细胞是Iwamoto et al[9]采用SSN-1细胞成功克隆出的对诺达病毒高度敏感，且能持续增殖的细胞株.RGNNV、SJNNV、红鳍东方鲀神经坏死病毒、条斑星鲽神经坏死病毒4种基因型VNNV在E-11细胞上的最适生长温度分别为25～30、20～25、20、15～20 ℃[9].与SSN-1细胞相比，E-11细胞生长更快、更稳定，且细胞病变更明显.本试验中，在27 ℃的培养条件下，E-11细胞较SSN-1细胞表现出对VNNV更高的敏感性及更明显的病变，这也与上述相关的研究结果相符.温度、pH、辐射等理化因子能影响病毒核酸的复制、转录和翻译等功能，或改变、破坏病毒颗粒的衣壳蛋白，影响病毒颗粒对宿主细胞的吸附和侵入，从而使病毒失去感染性，研究病毒的理化性质对于养殖生产中病原的预防控制具有重大的意义.Arimoto et al[20]研究表明，于20 ℃、pH 12的条件下处理10 min能够使当地SJNNV失去活性，因此将在pH为12的条件下处理10 min作为当地SJNNV的灭活程序.台湾地区的Chi et al[21]研究表明，石斑鱼的VNNV在60 ℃下处理1 h后完全失活，在pH为3和10～12的条件下处理后滴度明显下降.本试验结果显示，本试验分离到的VNNV经50 ℃及以上温度处理30 min后，滴度明显下降，至60 ℃病毒完全失活，推测该过程可能与病毒蛋白高温变性有关；此外，酸碱度敏感性检测结果显示该株VNNV对强酸或强碱敏感.针对VNNV理化特性的研究虽然采用的处理条件各不相同，但从研究结果可以推测VNNV对于强酸(pH<3)、强碱(pH>12)、高温(60 ℃以上)条件敏感.以上结果可为当地石斑鱼养殖场的病毒性神经坏死病预防控制提供参考.参考文献【相关文献】[1] 陈信忠.石斑鱼病毒性神经坏死病研究[D].厦门:厦门大学,2006.[2] MUNDAY B L , NAKAI T. 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“鱼类学”实验指导课程编号：12414350 专业：生物科学学时：39学时指导教师：龚小玲实验一鳞片、色素细胞鳍条的观察（3学时）实验目的：掌握鱼类不同的鳞片形式、鳞片的分区、鳞片上年轮的识别，色素细胞的分布、种类、形状，鱼类不同类型鳍条的形态，为鱼类学的进一步学习打下基础。

实验原理：鱼类的年轮的形成是有一定的规律，年轮有识别的标识，鳍条的硬棘、软条、假棘的形态结构是完全不同的。

实验对象：路氏双髻鲨、鲫鱼、鲈鱼、鲥鱼、鳕鱼的鳞片；金鱼的色素细胞，鲫鱼的软条、假棘，小黄鱼的硬棘实验药品与器材甘油溶液、NaOH溶液、解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子、玻片、透明胶、解剖镜、显微镜、烧杯、培养皿观察的主要内容：一鳞片1.盾鳞: 由表皮真皮发生(路氏双髻鲨)鳞棘(露在皮肤外的部分): 棘突棱突髓腔通孔基板(插入皮肤部分)2.硬鳞: 由真皮发生(软骨硬鳞类硬骨硬鳞类)3.骨鳞: 由真皮发生基本结构: 基区(前区) 顶区(后区) 上侧区下侧区鳞焦鳞嵴鳞沟年轮分类: 按栉刺的有无分圆鳞: 鲫(鳞焦偏顶区) 鳞嵴几呈同心圆排列鳞沟放射状(初级次级)鲥(鳞焦偏顶区) 鳞焦偏顶区鳞沟与鳞嵴波状(几乎平行)鳕(鳞焦偏顶区) 鳞焦偏基区鳞嵴呈小枕状鳞沟放射状(初级次级) 栉鳞: 鲈鱼顶区有栉刺其它同鲫鱼二色素细胞取活体金鱼彩色鳞片，放在载波片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察色素细胞的种类、形状等。

黑色素细胞(活体放射状可变形死后颗粒状)黄色素细胞(连成细胞)反光体三鳍条硬棘: 不分支不分节假棘: 不分支分节软条: 分支分节注意：显微镜观察盾鳞、栉鳞的栉刺、鳕鱼鳞片、色素细胞，其它使用解剖镜作业：1.画出鲫鱼、鲈鱼、路氏双髻鲨鳞片的示意图（注意各部分的比例），并标出各结构的名称2.画出硬棘、软条、假棘的示意图实验二~四鲫鱼、小黄鱼、鲳鱼的形态比较解剖（12学时）实验目的鲫鱼、小黄鱼、鲳鱼生活环境、生活方式、分类地位存在差异，对三者形态结构进行比较解剖，从而掌握它们形态结构的差异性及形态结构与功能的统一性。

第26卷第4期海洋水产研究Vol.26,N o.4 2005年8月M ARINE FISH ERIES RESEARCH Aug.,2005海水养殖鱼类弧菌病的研究进展杨少丽1,2王印庚2*董树刚1(1中国海洋大学,青岛266003)(2中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)摘要综述了由鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌等弧菌引起的海水养殖鱼类弧菌病的典型症状、病原学、病理、检测技术以及防治等方面的研究进展。

笔者对弧菌病的防治方法提出了一些有益的见解,另外对弧菌病的研究方向也进行了探讨和展望。

关键词海水养殖鱼病弧菌病检测技术防治中图分类号S941文献识别码A文章编号1000-7075(2005)04-0075-09Progress of research on vibriosis in marine cultured fishY A N G Shao-li1,2WA N G Y in-geng2*DON G Shu-gang1(1Ocean U niv ersity of China,Q ing dao266003)(2Y ellow Sea F isheries Research Inst itute,Chinese A cademy of Fisher y Scienses,Qing dao266071)ABSTRAC T T he paper summarized the research progress on the t ypical symptom,et iology, pat hology,det ective technology,the prevention and treatment of vibriosis caused by more than 10vibrio strains such as Vibrio anguil larum,V.alginoly ticus,V.harvey i and V.sp lendi-dus.T he authors provided some valuable recommendation on the prevention and t reatment f or these vibriosises,and t he f urther research direct ion w as also discussed.KEY WORDS M aricult ure Fish disease Vibriosis DiagnosisPrevention and treatment弧菌是引起海水养殖鱼类细菌性疾病的最重要的病原菌之一。