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低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立、成瘤性分析及应用研究低成瘤性MDCK单克隆细胞系的建立、成瘤性分析及应用研究引言：近年来，肿瘤细胞系的建立和应用研究在肿瘤研究领域取得了巨大的进展。
然而，目前存在的一些传统肿瘤细胞系在体内表现出较高的成瘤性和恶性特征，限制了其在肿瘤研究和药物筛选方面的应用。
因此，需要建立一种低成瘤性的肿瘤细胞系，以更准确地模拟体内肿瘤发展过程，并用于更有效的药物研发和治疗策略的开发。
一、MDCK单克隆细胞系的建立1. 研究方法本研究基于MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）细胞系，通过克隆形成单克隆细胞系。
首先，用限稀稀释法将MDCK细胞分散于培养基中，制备成单细胞悬浮液。
再将MDCK单细胞悬浮液均匀涂布于96孔培养板中，每个孔落仅含有一个细胞，并进行培养。
最后，挑选出生长正常、形成正常压膜和细胞结构完整的单克隆细胞株。
2. 建立的低成瘤性MDCK单克隆细胞系经过多次筛选和鉴定，我们成功建立了一株低成瘤性的MDCK单克隆细胞系。
通过形态观察、免疫组化染色和PCR等方法，确认该细胞系与传统MDCK细胞系在基因型和表型上存在一定差异。
低成瘤性细胞系具有更规则的形态、低迁移和侵袭能力，以及较低的增殖速率。
二、低成瘤性分析1. 形态学特征与传统MDCK细胞系相比，低成瘤性细胞系的细胞形态更规则，细胞间紧密排列，细胞大小均匀。
光镜下观察，细胞表面没有突起、伸展和口袋形成。
这些特征表明该细胞系在体内形成肿瘤的能力较低。
2. 体外功能特点通过胶原基质侵袭实验、Transwell迁移实验和MTT增殖实验，我们研究了低成瘤性细胞系在体外的功能特点。
与传统MDCK细胞相比，低成瘤性细胞系在胶原基质侵袭和细胞迁移能力方面表现较低，而在细胞增殖速率方面则较慢。
这些结果表明低成瘤性细胞系的肿瘤形成能力较差。
三、应用研究1. 肿瘤模型的构建在小鼠体内，将低成瘤性MDCK细胞系与其他传统MDCK细胞系注射到小鼠体内，观察两者在体内的生长和发展。
河南农业科学，2023，52（6）：131‐138Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi ：10.15933/ki.1004‐3268.2023.06.014稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO 细胞系的构建与鉴定孙雪珂1，2，丁培阳3，王思桥1，2，刘思源2，李明慧2，常泽杰2，陈艺兰2，李瑞琪2，张改平1，2，4（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001；4.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）摘要：为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV ）S1蛋白的CHO 细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S 1转染至CHO 细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。
利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA 方法检测重组S1蛋白活性。
将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c 小鼠，通过间接ELISA 、间接免疫荧光试验（IFA ）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。
结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5mg/L 的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV 阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。
综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。
关键词：猪δ冠状病毒；S1蛋白；CHO 细胞；稳定表达；蛋白质纯化中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）06-0131-08收稿日期：2023-01-14基金项目：河南省重大科技专项（221100110600）作者简介：孙雪珂（1997-），女，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：动物免疫学。
永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【摘要】The lentivirus system carrying hTERT gene was inserted to sheep lung fibroblasts (SLT) in order to establish an immortal cell line. Firstly, the recombinant lentiviral expression vector (pLOV-puro-hTERT) carrying hTERT gene was transfected into 293T cells. Subsequently, the primary SLT cells were infected with the rescued lentiviruses. The positive SLT cells expressing hTERT were selected with puromycin and examined with RT-PCR and Western blot. The results showed that hTERT gene was stably expressed in SLT cells, indicated that an immortalized SLT cell line had been established.%为了利用携带人源端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达系统将原代绵羊肺成纤维细胞进行永生化.本研究利用PCR技术从pBabe-neo-hTERT中扩增hTERT基因,并利用infusion技术构建重组慢病毒表达载体pLOV-puro-hTERT.将重组慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,拯救出慢病毒颗粒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中hTERT基因的转录和表达水平.筛选获得的阳性克隆,命名为SLT细胞系.SLT 细胞系连续传代后RT-PCR及Western blot 检测均显示hTERT稳定表达.本研究表明,我们成功构建了永生化绵羊肺成纤维细胞系.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】绵羊肺成纤维细胞;人端粒酶逆转录酶;永生化【作者】刘腾;董丹丹;张莉;朱杰;缪秋红;刘光清【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241【正文语种】中文【中图分类】S852.659.3传代细胞系是开展动物病毒应用和基础研究的重要平台，然而有许多动物病毒缺乏能支持其稳定增殖的本源宿主细胞系，例如小反刍兽疫病毒和兔瘟病毒，严重阻碍了这些病毒的分子生物学研究和疫苗研制工作。
猪FSP27基因过表达脂肪细胞系的构建与验证潘洪彬;孙泽威;李春雨;赵素梅;黄英;杨明华;高士争;秦贵信【摘要】脂肪特异蛋白27 (FSP27)是一种新发现的定位在脂滴的蛋白质,在调控脂肪细胞内脂类贮存等方面起着重要作用.本试验用含有猪FSP27基因的慢病毒,感染鼠3T3-L1前脂肪细胞,建立猪FSP27基因过表达的前脂肪细胞系,为进一步研究猪FSP27基因在脂肪细胞中调控脂类代谢提供实验素材.根据猪的FSP27基因序列设计目的基因引物序列,并分别添加酶切位点NheI和AgeI及保护碱基,克隆到pMD18-T载体做NheI和AgeI双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与GV341载体连接,转入293T细胞,包装成慢病毒,收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染3T3-L1前脂肪细胞,筛选稳定系,并检测感染效率和脂肪细胞表型变化.结果显示,猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞中FSP27基因的相对表达量显著高于对照组(P＜0.01),在过表达脂肪细胞培养第8天,脂肪细胞形成脂滴数量明显多于对照组(P＜0.05),表明猪FSP27基因过表达3T3-L1脂肪细胞系构建成功.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】6页(P588-593)【关键词】猪;FSP27基因;过表达;3T3-L1细胞系【作者】潘洪彬;孙泽威;李春雨;赵素梅;黄英;杨明华;高士争;秦贵信【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;云南农业大学动物科技学院,云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明650201;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;广东农工商职业技术学院,广东广州510507;云南农业大学动物科技学院,云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学动物科技学院,云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学动物科技学院,云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学动物科技学院,云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明650201;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S828.133动物的脂肪组织在维持其机体的能量代谢平衡和糖、脂肪代谢稳态中起着重要作用，当脂肪代谢紊乱时会导致机体的过渡肥胖、脂肪肝等一系列代谢疾病。
实验名称：细胞系建立与鉴定实验时间：2023年X月X日实验地点：实验室一、实验目的1. 掌握细胞系的建立方法。
2. 了解细胞系的鉴定方法。
3. 观察细胞系在不同培养条件下的生长情况。
二、实验原理细胞系是指经过体外培养后，能够在一定条件下无限增殖的细胞群体。
细胞系的建立通常从原代细胞开始，通过多次传代培养，使其在体外条件下保持稳定生长。
细胞系的鉴定主要包括细胞形态、染色体数目、细胞周期、细胞表面标志物等方面。
三、实验材料1. 原代细胞：小鼠胚胎成纤维细胞。
2. 细胞培养液：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素。
3. 试剂：胰蛋白酶、DNA染色剂、细胞周期检测试剂、细胞表面标志物抗体。
4. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、移液器、酶标仪等。
四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取小鼠胚胎组织，剪成1mm³大小的组织块，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
（2）将细胞悬液接种于培养皿中，放入细胞培养箱中培养。
（3）每日观察细胞生长情况，待细胞融合至80%时，用胰蛋白酶消化传代。
2. 细胞系建立（1）将原代细胞传代培养，观察细胞生长情况。
（2）当细胞生长稳定后，收集细胞，进行细胞系鉴定。
3. 细胞系鉴定（1）细胞形态观察：在显微镜下观察细胞形态，记录细胞大小、形状、密度等特征。
（2）染色体数目检测：将细胞进行DNA染色，制作染色体涂片，观察染色体数目。
（3）细胞周期检测：将细胞进行细胞周期检测试剂染色，观察细胞周期分布。
（4）细胞表面标志物检测：将细胞进行细胞表面标志物抗体染色，观察细胞表面标志物表达情况。
五、实验结果1. 细胞形态：细胞呈长梭形，细胞核较大，细胞密度较高。
2. 染色体数目：细胞染色体数目为2n=40。
3. 细胞周期：细胞周期分布为G1期、S期、G2期、M期，比例约为1:1:1:1。
4. 细胞表面标志物：细胞表面表达CD29、CD44等标志物。
六、实验讨论1. 细胞系建立过程中，应注意无菌操作，避免污染。
2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。
对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。
结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。
关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。
BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。
杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。
目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。
本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。
1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。
1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。
培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。
1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。
克氏综合征胚胎干细胞的建系及鉴定☆柯琼;黄敏珍;李伟强;王涛;项鹏【摘要】10.3969/j.issn.2095-4344.2012.36.009% 背景：克氏综合征是一种染色体异常引起的先天性疾病,对于该疾病发生和染色体异常的分子机制还未明确.目的：建立克氏综合征的胚胎干细胞系,并鉴定其是否具有正常胚胎干细胞特性.方法：胚胎培养至囊胚,经免疫外科法分离内细胞团培养获得人胚胎干细胞系.Giemsa染色鉴定核型,免疫荧光染色及体外、体内分化实验鉴定其生物学特性.结果与结论：从5个胚胎中获得1株克氏综合征胚胎干细胞系,该细胞系具有47,XXY核型.经鉴定该细胞具有碱性磷酸酶活性,并表达Nanog、OCT-4、SSEA-4、Sox2、TRA-1-60等胚胎干细胞特异标记物,可形成拟胚体,并在体内外可以分化为三胚层的细胞类型.该细胞株的建立为研究该遗传病的发病机制及性染色体的功能提供了一个良好的细胞模型.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2012(000)036【总页数】6页(P6696-6701)【关键词】克氏综合征;核型;人胚胎干细胞;细胞建系;生物学特性;染色体异常;干细胞【作者】柯琼;黄敏珍;李伟强;王涛;项鹏【作者单位】中山大学干细胞与组织工程中心,广东省广州市510080;解放军广州军区武汉总医院生殖医学中心,湖北省武汉市430060;中山大学干细胞与组织工程中心,广东省广州市510080; 中山大学中山医学院生物化学教研室,广东省广州市510080;中山大学干细胞与组织工程中心,广东省广州市510080;中山大学干细胞与组织工程中心,广东省广州市510080; 中山大学中山医学院生物化学教研室,广东省广州市510080【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言克氏综合征是一种由染色体异常引起的先天性疾病，主要表现为男性染色体核型中X染色体增多，其中约80%的细胞核型是47，XXY[1]。
