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研究背景正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。
有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。
然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6，而人类细胞则更为罕见，小于10-12。
通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。
研究意义永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，并且可以降低材料成本，因此，它是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，加之，永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，所以永生化细胞也是研究肿瘤发生机制的重要模型。
另外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供更多的细胞资源。
研究方法目前，人们已建立了多种细胞永生化的方法，包括：1病毒基因转染很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。
这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。
EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。
EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。
目前，EB 病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。
SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。
应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
BLTR-4永生化细胞系的建立及生物学特性初步鉴定郑闪;郭素萍;何祖根;程书钧;高燕宁【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2004(026)005【摘要】目的建立膀胱尿路上皮永生化细胞系,并初步鉴定其生物学特性.方法以Fugene-6TM为载体,将含人乳头瘤病毒16(HPV-16)E6、E7基因的HPV-16K质粒,体外转染原代培养的正常胎儿膀胱尿路上皮细胞.运用PCR、免疫组织化学及细胞特征鉴定等方法,对所得BLTR-4细胞系中HPV-16 E6、E7基因的存在情况及该细胞系生物学特性进行初步鉴定.结果 BLTR-4细胞系是含有HPV-16 E6、E7基因并表达上述两种蛋白的尿路上皮源性细胞系.该细胞在体外已传70余代,细胞倍体数发生了二倍体至四倍体再至非整倍体的改变,生长特性符合永生化细胞系.结论BLTR-4细胞系是膀胱尿路上皮永生化细胞系,该细胞系含有HPV-16 E6、E7基因.BLTR-4细胞系的建立为研究高危型HPV感染与膀胱移行细胞癌(TCC)关系提供了体外实验模型.【总页数】6页(P543-548)【作者】郑闪;郭素萍;何祖根;程书钧;高燕宁【作者单位】中国医学科学院,中国协和医科大学,肿瘤医院病理科,北京,l00021;Department of Carcinogenesis,Cancer Hospital, CAMS and PUMC, Beijing;中国医学科学院,中国协和医科大学,肿瘤医院病理科,北京,l00021;Department of Carcinogenesis,Cancer Hospital, CAMS and PUMC,Beijing;Department of Carcinogenesis,Cancer Hospital, CAMS and PUMC, Beijing【正文语种】中文【中图分类】R737.14【相关文献】1.永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究 [J], 张然星;李宓;张文健;顾锋;门秀丽;叶丽亚;房青;徐梅;高福云;娄晋宁2.人卵巢癌永生化细胞系BUPH:OVSC-2的建立及其生物学特性研究 [J], 冯捷;刘广芝;付天云;叶雪;姚煜3.永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析 [J], 宋慧子; 栾兆进; 王兆琛; 杜炜; 赵勇超; 张家新4.人类黑色素细胞瘤永生化细胞系的建立及生物学特性鉴定 [J], 曾先捷;蔡捷;姚洁民;黄英华;郭春雨;马赫;李小平;邝晓聪5.人卵巢浆液性囊腺癌永生化细胞系BUPH∶OVCA-3的建立及其生物学特性 [J], 刘广芝;冯捷;付天云;叶雪;昌晓红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景张敏;陈小云;王磊;王栋;蒋桃珍;王静文【摘要】Immortalized cells induced by human telomerase reverse transcriptase ( hTERT) are ideal cell source for their biological specificity of primary cell line and infinite proliferative capacity of passage cell line. They have shown superior advantage in fundamental research, clinical application and bioengineering. In this review, we introduced research progress and application prospect of immortalized cells induced by hTERT.%人端粒酶逆转录酶基因（ hTERT）诱导的永生化细胞兼具原代细胞的生物学特性和传代细胞系连续传代的能力，是一种理想的细胞来源，在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势。
本文主要就hTERT永生化细胞的研究进展及应用前景作一综述。
【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P58-62)【关键词】永生化;端粒;端粒酶;人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)【作者】张敏;陈小云;王磊;王栋;蒋桃珍;王静文【作者单位】中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081;中国兽医药品监察所，北京100081【正文语种】中文【中图分类】Q28正常细胞因其有限的增殖能力使其在基础研究、临床应用和生物工程领域的作用受到局限。
![一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/a694cd5b7f21af45b307e87101f69e314232fa56.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011577037.2(22)申请日 2020.12.28(71)申请人 上海市皮肤病医院地址 200050 上海市长宁区武夷路200号(72)发明人 王秀丽 许德田 刘佳 (74)专利代理机构 苏州润桐嘉业知识产权代理有限公司 32261代理人 吴剑峰(51)Int.Cl.C12N 15/867(2006.01)C12N 15/54(2006.01)C12N 5/10(2006.01)C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用，切取人的面部皮肤，去除表皮层和皮下组织，分离得到皮脂腺，加入增殖培养液进行原代培养，制备H ‑tert慢病毒感染细胞连续传代至50代得到稳定细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功。
针对人皮脂腺组织细胞的特征，采用中性蛋白酶、EDTA对组织块进行消化，将消化后的组织块移植到培养瓶中，加入增殖培养液进行原代培养，病毒液感染细胞株筛选后连续传代继而成功构建人皮脂腺细胞系。
通过本发明的方法构建的人皮脂腺细胞系，具有连续传代的能力；稳定传代后，细胞呈长梭状，并经相关细胞株鉴定证明该细胞系是一种特性稳定、成分均一的中国人皮脂腺细胞系，是作为研究皮脂腺相关疾病的良好材料。
权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 112608947 A 2021.04.06C N 112608947A1.一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)组织块的处理：切取人面部皮肤，在青霉素‑链霉素双抗溶液中浸泡，酒精消毒处理，用含两性霉素B的HBSS冲洗，无菌条件下去除皮下脂肪，将皮肤组织剪成组织小块，将组织小块浸泡在中性蛋白酶和EDTA中消化过夜；剥离表皮层，分离得到皮脂腺；2)原代培养：将组织块移植到培养瓶中，用增殖培养液进行培养；3)传代培养：原代培养细胞长成单层后，加入胰蛋白酶静置消化，然后用增殖培养液培养细胞，以1:2进行传代，进行传代培养，并进行细胞的生物学标记鉴定；4)H‑tert病毒培养液制备：pMXs‑H‑tert逆转录病毒载体与逆转录病毒包装质粒包括VSVG和Gag.Pol共转染293FT细胞后得到的包装体；5)病毒液感染：将二代的皮脂腺细胞培养，加入步骤4)的病毒培养液，得到感染细胞株，开始第一次传代，以后每72‑96h传代一次；6)步骤5)中的感染细胞系连续传代至50代得稳定细胞系，永生化皮脂腺细胞系构建成功；所述增殖培养液为含有5‑10％胎牛血清、10‑40ng/ml表皮生长因子、1‑5ng/ml I性胰岛素样细胞生长因子、100‑400IU/ml青霉素、100‑400ug/ml链霉素、0.25‑2ug/ml两性霉素B 的DMEM/F‑12培养液。
![一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/0a0e85f56037ee06eff9aef8941ea76e58fa4a64.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810804437.9(22)申请日 2018.07.20(71)申请人 东南大学地址 211102 江苏省南京市江宁区东南大学路2号(72)发明人 陈陆馗 张桂龙 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204代理人 孙斌(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C12N 15/867(2006.01)(54)发明名称一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L -myc基因的重组慢病毒载体；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。
本发明永生化细胞系的制备方法是一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略；制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，同时该细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然可以快速增殖，并且无致瘤性。
权利要求书1页 说明书9页序列表2页 附图8页CN 108866005 A 2018.11.23C N 108866005A1.一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L -myc基因的重组慢病毒载体pLenti -EF1a -EGFP -P2A -Puro -CMV -MYCL -3Flag；(3)对重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)采用慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。
2.根据权利要求1所述的永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离培养原代人海马来源神经干细胞的具体步骤为：(A)收集自然流产终止妊娠的3月胎儿脑组织；(B)显微分离获取海马，浸于培养基中，用显微剪剪碎海马组织，随后胰酶消化，离心，用完全培养基重悬，过滤网，分瓶培养，换液传代；(C)取第1代神经干细胞鉴定Nestin、Sox2、Musashi1的Marker表达，以及诱导分化后分化为三系--神经元、星形神经胶质和少突胶质细胞分别鉴定Tuj1、GFAP、MOG的Marker表达。
《中国癌症杂志》2019年第29卷第9期 CHINA ONCOLOGY 2019 Vol.29 No.9693欢迎关注本刊公众号·论 著·基金项目：国家自然科学基金青年项目（81402153）。
通信作者：童国庆 E-mail: drivftongguoqing@一株永生化的BRCA 1突变型人卵巢表面上皮细胞系的建立及初步分析任春霞1,2，夏小艾2，杨树东3，吕 蓓2，童国庆11.上海中医药大学附属曙光医院生殖医学中心，上海 200120；2.无锡市人民医院妇产科，江苏 无锡 214023；3.无锡市人民医院病理科，江苏 无锡 214023［摘要］ 背景与目的：BRCA 1突变女性患乳腺癌和卵巢癌的风险增加，然而，目前尚不清楚BRCA 1的单个等位基因突变如何导致癌症的发生，建立BRCA 1突变的永生化细胞系可能为此类肿瘤发生的研究提供一个有用的模型。
方法：从无锡市人民医院收治的1例携带BRCA 1单等位基因185delAG 突变患者的正常卵巢组织中分离和建立了卵巢表面上皮细胞系OSE236；然后利用反转录病毒系统介导的技术，用特异的shRNA 稳定沉默p53表达，并导入人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase ，hTERT ）催化亚基和致癌基因HRAS ，构建了系列细胞系并测定了其生长、衰老、细胞周期及致瘤特性。
结果：成功建立了永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT ，但在该永生化细胞中导入致癌基因HRAS 所构建的细胞系OSE236/p53i/hTERT/HRAS 并未在体外和体内诱导肿瘤的转化。
对该系列细胞系进行研究发现，与原代细胞系OSE236相比，永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT 中的β-半乳糖苷酶活性明显降低，而该BRCA 1突变在所有系列细胞系中都存在，细胞周期随永生化明显增强，相关细胞周期调节蛋白（如CDK4、Cyclin B1/Cyclin D1/Cyclin E ）上调，该永生化细胞系目前已在体外传代超过100代。
人类输卵管上皮细胞培养
钟瑜;张春雪
【期刊名称】《暨南大学学报：自然科学与医学版》
【年(卷),期】1996(017)001
【摘要】从１６例妇女的正常输卵管标本中获取壶腹部上皮细胞建立体外培养并
传代，通过倒置显微镜和相差显微镜观察细胞形态及生长状况，所有标本的细胞均可在培养的６￣９ｄ形成融合的单层细胞，并可传代４￣６次，每次历时５￣７ｄ，最长的培养可维持３５ｄ，与提供标本的妇女的月经周期及年龄关系不大。
【总页数】5页(P86-90)
【作者】钟瑜;张春雪
【作者单位】生殖免疫研究中心;生殖免疫研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q343.6
【相关文献】
1.人输卵管液和输卵管上皮细胞培养液诱发精子的顶体反应 [J], 张春雪;朱伟杰;钟瑜
2.不同物种输卵管上皮细胞培养、纯度检测及支持小鼠胚胎发育的能力 [J], 谭秀文;马所峰;刘新勇;张霞;兰国成;于建宁;张俊功;谭景和
3.牛输卵管上皮细胞培养、纯化及其生物学特性的研究 [J], 孙伟;李喜和;郭继彤;
巴特尔;杨利国
4.蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系的建立 [J], 唐博;白萨日娜;李淑凤;曹贵方
5.人类输卵管上皮细胞培养 [J], 钟瑜;张春雪;潘善培
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改良人输卵管上皮细胞培养法及电镜观察毛跟红;高颖;李红发;赵虹;沈怡;闵洁【期刊名称】《生殖医学杂志》【年(卷),期】2005(014)002【摘要】目的简化人输卵管上皮细胞分离及培养方法,提高上皮细胞纯度.方法收集19例子宫肌瘤或子宫腺肌病等手术切除的输卵管进行上皮细胞体外培养.改良酶消化法和刮取法收集人输卵管上皮细胞,采用溶血法及差速贴壁法纯化上皮细胞.观察上皮细胞生长及特征,免疫组织化学检测其纯度,扫描和透射电镜评价细胞超微结构.结果改良法培养的人输卵管上皮细胞占细胞总数＞90%;电镜显示原代培养的细胞具有微绒毛及纤毛等上皮细胞特征,部分纤毛细胞的胞膜游离面有球状突起,细胞内可见含电子致密物或暗物质的囊泡.结论本改良法方法简单,培养的人输卵管上皮细胞纯度高,电镜结果有利于输卵管上皮细胞分化的研究.【总页数】4页(P86-89)【作者】毛跟红;高颖;李红发;赵虹;沈怡;闵洁【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,湖北,武汉,430022【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.人输卵管液和输卵管上皮细胞培养液诱发精子的顶体反应 [J], 张春雪;朱伟杰;钟瑜2.人输卵管上皮细胞培养液对人精子活力的影响 [J], 赵玲3.人类输卵管上皮细胞培养 [J], 钟瑜;张春雪4.早期人胎输卵管上皮纤毛细胞的初步电镜观察 [J], 赵卫华;郭祖文5.人类输卵管上皮细胞培养 [J], 钟瑜;张春雪;潘善培因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《中国癌症杂志》2013年第23卷第4期 CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No.4241人类输卵管上皮永生化细胞系的建立及鉴定高雯1,2 臧荣余1 王雁2 杨丽娜2 刘杨1 亓子豪2 尹胜1 杨恭21.复旦大学附属肿瘤医院妇科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032；2.复旦大学附属肿瘤医院实验研究中心，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032 ［摘要］ 背景与目的：最近研究表明卵巢高级别浆液性癌可能起源于输卵管上皮。
本课题通过基因沉默和端粒酶导入技术将原代输卵管上皮细胞永生化，为以后建立恶性转化细胞系和卵巢癌动物模型奠定基础。
方法：分离并培养输卵管上皮细胞，导入p53和pRb shRNA结合hTERTcDNA，建立p53和pRb基因同时沉默并过表达hTERT的永生化细胞系，并对永生化细胞系进行连续传代、沉默基因的蛋白质印迹法(Western blot)测定、SA-β-gal染色和非停泊生长实验及体内致瘤活性鉴定。
结果：我们建立了稳定表达p53、pRbshRNA和hTERT的永生化输卵管上皮细胞系：FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/p53i+pRbi+hTERT。
结论：可以通过导入端粒酶基因及敲除抑癌基因p53和pRb来建立永生化细胞系,并有望于构建恶性转化细胞系和人类高级别浆液性卵巢癌动物模型。
［关键词］ 输卵管上皮细胞；p53；pRb；hTERT；永生化 DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.00X 中图分类号：R737.32 文献标志码：A 文章编号：1007-3639(2013)04-0241-07Immortalization of human fallopian tube epithelial cells GAO Wen 1,2, ZANG Rong-yu 1, WANG Yan 2, YANG Li-na 2, LIU Yang 1, QI Zi-hao 2, YIN Sheng 1, YANG Gong 2 (1.Departements of Gynecological Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)Correspondence to: YANG Gong E-mail: yanggong@ ［Abstract ］ Background and purpose: Recent researches indicate that high grade serous ovarian carcinoma is derived from fallopian tube epithelial malignancy. In this study, we used primary fallopian tube epithelium to establish the immortalized cell lines by silencing of tumor suppression genes and introduction of hTERT, in order to further build malignant cell lines and ovarian cancer animal models. Methods: Primary fallopian tube epithelia were isolated and transfected with a plasmid containing pRb and p53 shRNAs combined with hTERT to establish immortalized cell lines. The resulting cells were validated through examining cell population doublings, p53 and pRb expression, SA-β-gal activity; anchorage-independent growth and in vivo tumorgenesis. Results: We successfully established two immortalized fallopian tube epithelial cell lines: FTE248116/p53i+pRbi+hTERT, FTE312249/p53i+pRbi+hTERT through silencing of p53 and pRb and introduction of hTERT simultaneously. Conclusion: The establishment of immortalized cell lines can be accomplished by introduction of p53 and Rb shRNA and overexpression of hTERT, and these cells may be used to establish the transformed cell lines and ovarian cancer animal models. ［Key words ］ Human fallopian tube epithelia cells; p53; pRb; hTERT; Immortalization基金项目：国家自然科学基金项目(No: 81171911)。
通信作者：杨恭 E-mail:yanggong@ 卵巢癌(ovarian cancer)是致死率最高的妇科恶性肿瘤。
在原发性卵巢癌中，75%～90%是上皮性癌。
目前越来越多的证据表明：高级别浆液性卵巢上皮性癌起源于输卵管上皮，卵巢只是继发受累。
无论从形态学分析还是经过蛋白组学分析都证实高级别浆液性卵巢癌起源于输卵管上皮［1］。
正常上皮细胞在体外连续传代6～15242高雯，等. 人类输卵管上皮永生化细胞系的建立及鉴定次后出现生长阻滞、复制危机乃至衰老死亡，而癌变细胞的最大特性却是永生不老［2］。
细胞永生化是细胞恶性转化的必经阶段。
所谓的 “永生化” 是指培养细胞在体外能稳定传代、生长，但又不发生恶性转化，即不具有癌细胞的特征，这有助于体外研究［3］。
抑癌基因p53和pRb的失活是人体细胞获得永生化的必要条件［4-6］。
为了克服细胞分裂过程中端粒缩短现象，在正常细胞中导入端粒酶反转录酶催化亚基基因(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前用于维持端粒结构完整和稳定的最有效途径，可防止细胞复制性衰老，使正常上皮细胞永生化［7-9］。
因此，本课题用shRNA 沉默p53和pRb基因表达，并结合hTERT转导的方法建立永生化的人类输卵管上皮(fallopian tube epithelia，FTE)细胞系。
1 材料和方法1.1 组织来源 选取复旦大学附属肿瘤医院2011年手术切除标本：宫颈癌Ia期的输卵管组织，经病理证实输卵管正常。
1.2 主要试剂 细胞培养液：培养正常人类卵巢表面上皮细胞是用MCDB培养液和 M199培养液以1∶1混合，加入10%～20%的胎牛血清，20 ng/mL的上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)和1%的青霉素及链霉素。
研究表明MCDB不仅能促进正常人类卵巢表面上皮细胞的生长潜能，而且能维持其上皮表型。
胰酶2.5% trypsin购自Gibco公司。
胎牛血清购自Gibco公司。
MTT粉购自Sigma公司。
双抗购自Biowest 公司。
GENMED细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒购自上海杰美医药科技有限公司。
低熔点琼脂糖购自Biowest。
CK-7/17 (628701，按1∶1 000稀释)购自Biolgend公司；E-cadherin(BD 6101820，按1∶2 000稀释)购自BD公司；pRb抗体购自(G3-245，按1∶2 000稀释)购自BD公司；p53抗体(sc-1261，按1∶1 000稀释)购自Santa cruz公司；β-actin(A5441，1∶2 000)购自Sigma公司。
hTERT(sc-7212，按1∶1 000稀释)购自Santa cruz公司。
对照卵巢癌细胞系SKOV3 购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
动物实验在复旦大学上海医学院动物实验中心完成，实验动物购自BK公司。
1.3 正常输卵管上皮细胞的分离和培养 用无菌手术刀片切取输卵管标本后，立即放入无菌细胞培养皿中并将培养皿置于冰上，拿到原代细胞培养房内，此过程不超过15 min。
然后在生物安全柜内操作，保证整个过程都无菌：将组织块用无菌镊子移到一个新的细胞培养皿，用加入10% 双抗的PBS温和的清洗表层上皮3次，每次5 min，然后用培养基清洗1次，洗过之后将培养基吸掉，加入新鲜培养基，用无菌手术刀片温和地刮输卵管的表面细胞，也可用刀背钝性刮取。
直到把整个组织块刮到非常小不能再刮取为止。
将培养皿放到37 ℃、CO2体积分数为5%的温箱进行培养。
3 d之后更换培养基，一般经过5~6 d可以看到明显的贴壁细胞，以后每2 d观察1次细胞，隔3 d更换1次培养基。
在正常情况下，14 d后，细胞长满培养皿。
当细胞密度长到80%~90%时，用胰酶消化并以1∶3进行细胞传代。
如果上皮细胞中参杂有间质细胞，可以采用以下方法移除：将培养基吸弃，加入PBS温和地冲洗2次，加入0.5 mL 0.05%的胰酶在培养皿中，左右摇晃使胰酶铺平培养皿的底部，然后在显微镜下持续观察，大约60 s 后，成纤维细胞脱离皿的底部而上皮细胞仍然贴壁，此时立即用培养基中和，从而将上皮细胞和成纤维细胞分开，上皮细胞传代2～3次就可以得到纯化的上皮细胞。
