细胞系的建立及鉴定

基因突变细胞系的构建英文回答：Building a cell line with gene mutations requires several steps and techniques. First, we need to identifythe specific genes that we want to mutate. This can be done through various methods, such as genetic screening or studying the genetic profile of cancer cells. Once we have identified the target genes, we can proceed to introducethe desired mutations.One common method for introducing gene mutations is through the use of CRISPR-Cas9 technology. Thisrevolutionary tool allows us to precisely edit the DNA sequence and introduce specific mutations. By designing guide RNA molecules that are complementary to the target genes, we can guide the Cas9 enzyme to the desiredlocations and induce double-strand breaks in the DNA. The cell's natural repair mechanisms then kick in, and duringthe repair process, the desired mutations can be introduced.Another approach is to use chemical mutagens or radiation to induce random mutations in the cells. This method is less precise but can be useful when studying the effects of multiple mutations or when specific genes are difficult to target using CRISPR-Cas9.Once the mutations have been introduced, the next step is to select and isolate the cells that carry the desired mutations. This can be achieved through various methods, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by using selective media that only allows the growth of cells with specific mutations.After isolating the mutant cells, it is important to verify the presence of the desired mutations. This can be done through DNA sequencing or by using specific assaysthat detect the mutated genes or their protein products. It is also crucial to confirm that the mutant cells exhibit the expected phenotypic changes, such as altered growth characteristics or increased resistance to certain drugs.Once the mutant cell line has been established and validated, it can be used for further studies, such as investigating the effects of the mutations on cellular processes or testing the efficacy of potential therapeutic interventions.中文回答：构建基因突变细胞系需要几个步骤和技术。

细胞系质量检测方法常见的细胞系质量检测方法包括鉴定、微生物污染检测和细胞功能检测。

首先，细胞鉴定是确定细胞系特定属性的方法，例如细胞类型、起源和物种。

常用的鉴定方法包括形态学观察、细胞异质性检测、免疫细胞化学和分子生物学技术。

形态学观察可以通过显微镜观察细胞形态、大小和有无分化等特征，但此方法存在主观性，且一些细胞具有相似的形态特征。

细胞异质性检测通过染色体分析来确定细胞的遗传背景，但此方法通常需要复杂的样本准备和数据分析。

免疫细胞化学是利用特定抗体与目标细胞表面分子结合来鉴定细胞类型，然而，不同抗体对同一细胞的结合具有差异性。

分子生物学技术包括多态性分析、特定基因扩增和DNA测序等方法，可以确定细胞的基因型和物种起源，但此方法对实验条件和技术要求较高。

其次，微生物污染检测是确定细胞系是否受到细菌、真菌或病毒等微生物污染的方法。

细胞培养需要在无菌条件下进行，以确保细胞系的纯度和稳定性。

常用的微生物污染检测方法包括培养基上的菌落形成、荧光染色、PCR和细胞培养活力检测。

菌落形成可以依靠培养基上的微生物进行观察，但此方法需要较长时间，且不适用于一些微生物的检测。

荧光染色方法利用荧光标记的抗体或化学物质来检测微生物污染，具有高灵敏度和特异性，但需要特殊仪器和试剂。

PCR技术通过扩增微生物DNA的特定序列来进行污染检测，具有高灵敏度和快速反应时间，但此方法对实验条件和技术要求较高。

细胞培养活力检测是通过观察细胞的形态和增殖能力来判断细胞系是否受到微生物污染的影响，但此方法对培养条件和经验要求较高。

最后，细胞功能检测是评估细胞系在特定功能上的表现的方法。

常用的细胞功能检测方法包括细胞增殖分析、细胞凋亡检测、细胞迁移和侵袭性分析以及细胞分化能力评估。

细胞增殖分析可以通过细胞计数、半胱氨酸酶活性测定和代谢活性测定等方法来评估细胞的增殖能力，但此方法受细胞生长状态和培养条件的影响。

细胞凋亡检测通过观察DNA断裂和细胞膜破裂等指标来评估细胞凋亡程度，但此方法需要特殊试剂和检测仪器。

CRISPR/Cas9 实验流程交流企鹅: 2621697472（大家做哪块？）一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程1.1 确定待敲除基因的靶位点1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）1.3 构建表达sgRNA的质粒1.4 sgRNA活性检测1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。

找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。

按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。

对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。

如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。

1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。

一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。

而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。

因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。

不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。

因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。

细胞培养技术的发展历程细胞培养技术是指将单个细胞或组织细胞在合适的培养基中进行体外培养，以便研究细胞的生物学特性和进行相关实验。

随着科学技术的进步，细胞培养技术得到了长足的发展，为生物医学研究、药物筛选和组织工程等领域提供了强有力的支持。

本文将从细胞培养技术的起源开始，梳理其发展历程，并介绍一些重要的应用。

一、起源细胞培养技术的起源可以追溯到19世纪末，当时德国生物学家埃尔恩斯特·埃尔门德尔首次成功地将组织细胞培养于离体环境中。

他利用鸟胚的细胞培养实验，为后来细胞培养技术的发展奠定了基础。

二、早期发展20世纪初，细胞培养技术得到了进一步的发展。

1912年，美国生物学家亨利·麦克莱兰（Ross Granville Harrison）成功地将脊椎动物的神经细胞培养了数天，并观察到了神经细胞的生长和分化。

这一突破为后来的组织细胞培养提供了有力的依据。

随着培养基的改良和培养条件的优化，细胞培养技术在20世纪中叶取得了长足的进展。

1948年，美国细胞生物学家乔治·盖雅在培养基中添加鸡胚液，成功地培养出了人类胚胎肾细胞。

这一突破标志着细胞培养技术进入了一个新的阶段。

三、细胞系的建立20世纪50年代，细胞系的建立成为细胞培养技术的重要发展方向。

细胞系是指从原代细胞中分离出来的、能够在体外长期生长和繁殖的细胞群。

1951年，美国生物学家乔治·盖雅与吉斯特·萨尔特成功地建立了人类胚胎肾细胞系，被称为“Hela细胞”。

这一细胞系的建立对于研究细胞生物学和药物筛选具有重要意义。

四、培养技术的改进随着细胞培养技术的发展，人们对培养条件进行了不断的改进。

1960年代，美国细胞生物学家菲利普·拉斯克和约翰·哈米尔顿开发出了一种新的培养基，被称为“DMEM”，为细胞培养提供了更适宜的生长环境。

此后，培养技术的改进主要集中在培养基的配方和培养条件的优化上。

人们通过添加多种生长因子、维生素和抗生素等物质，使细胞在培养基中能够更好地生长和分化。

实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。

3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。

筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。

在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。

待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。

实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。

转染方法同瞬时转染。

2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。

文章编号:100025404(2004)1321171204 论著猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定丁生财1,陈意生1,魏　泓2,刘　萍3 (第三军医大学:1西南医院病理科,2实验动物中心,重庆400038,3新桥医院妇产科,重庆400037) 提　要:目的　研究猪内源性逆转录病毒在体内和体外的感染性,建立理想的细胞模型,为猪一人间跨种移植的生物安全性评价奠定良好的基础。

方法　运用组织块培养法、冷胰蛋白酶方法及热胰蛋白酶方法培养猪皮肤成纤维细胞,比较3种方法的优点和缺点。

结果　建立了猪皮肤成纤维细胞系组织块培养法优于胰酶法。

结论　应用组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞优于胰酶法,经济实惠、操作简便、易于掌握;并为研究PERV在体内和体外的感染性提供了理想的细胞模型,为评估猪一人间跨种移植的生物安全性提供一种新的方法;对建立动物克隆生产的皮肤体外培养模式具有重要的参考价值。

关键词:成纤维细胞;猪内源性逆转录病毒;异种移植;生物安全性;感染;培养;皮肤;猪 中图法分类号:R322.99;R329.2 文献标识码:ACultivation and identification of porcine skin fibroblastsDI NG Sheng2cai1,CHE N2Y i2sheng1,WEI H ong2,LI U Ping3(1Research Institute of Pathology,S outhwest H ospital,2Department of Lab2 oratory Animal Science,3Department of Obstetrics and G ynecology,X inqiao H ospital,400037,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective s　T o establish an ideal cellular m odel for the study of in fection of porcine endogenous ret2 rovirus in intro and in vivo and to lay the foundation for evaluating the biological safety of xenotransplantation.Meth2 ods　P orcine skin fibroblasts were cultured by tissue pieces,cold trypsin,and heat trypsin,respectively.The merit and defect of these methods were analyzed.Re sults　P orcine skin fibroblast line was established and the tissue piece method was superior to trypsin methods.Conclusion　Culture of porcine skin fibroblasts with tissue pieces is superi2 or to trypsin method,with the characteristics of low cost and easy operation.The established porcine skin fibroblast cell line supplies an ideal cell m odel for the study of in fection of porcine endogenous retrovirus in vitro and in vivo, provides a new method for the evaluation of biological safety of xenotransplantation,and plays an im portant role in the skin culture m odel of production of cloned animals. K ey w ords:fibroblast cell;porcine endogenous retrovirus;xenotransplantion;biological safety;in fection;cul2 ture;skin;pig 猪器官、组织和细胞作为猪一人间跨种移植的供体源具有广阔的前景,但其基因组载有猪内源性逆转录病毒前病毒序列,可能导致猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)种间传播发生的潜在危险。

KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立摘要将 KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。

本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。

关键词 KIF5B-RET基因；慢病毒载体；肺癌细胞一、引言RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为独立的新的分子亚型[1]。

Cabozantinib等几种市售的多靶点激酶抑制剂均能抑制RET激酶活性[2]，但特异的小分子抑制剂需进一步研究开发。

慢病毒表达载体具有高转染效率，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，且长期表达。

本研究通过成功构建KIF5B-RET基因慢病毒载体，建立稳定表达 KIF5B-RET的肺癌细胞系，为药物开发及筛选奠定基础。

二、材料与方法1.材料慢病毒载体 pLenti6.3_MCS（图1）购自Invitrogen公司，KIF5B-RET融合基因质粒由本实验室保存。

293T细胞购自中科院上海细胞库。

限制性内切酶 PacI、AscI、T4 DNA ligase购自NEB公司。

Lipofectamine2000购自 Invitrogen 公司。

质粒提取、胶回收试剂盒购自Biomiga公司。

2. 慢病毒表达载体的构建及鉴定用PacI / AscI把质粒37℃酶切2小时，电泳回收后，用T4 DNA ligase连接回收的片段与载体。

取10ul连接产物转化感受态细胞DH5a。

涂平板挑取单克隆摇菌，质粒中抽试剂盒提取质粒。

3. 病毒包装取 293T细胞按照每个10cm的培养皿6x106个细胞数铺板。

第2天，取9ug PackagingMix和 3ug慢病毒质粒加入1.5ml Opti-MEM混匀。

取36ul lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，混匀后将3ml复合物加入到细胞中过夜，换用培养基后培养3 d，收获细胞培养上清，分装，－80℃保存。

人永生化胰腺星形细胞系的构建及其功能的验证韩世纪1，2，练国达1，2，陈少杰1，2，黄开红1，2*，李佳佳1，3*［摘要］目的构建人永生化胰腺星形细胞（PSCs）系并探讨其生物学功能。

方法采用outgrowth方法提取人原代胰腺星形细胞（hPSCs），慢病毒感染方法导入SV40LT基因和hTERT基因，嘌呤霉素筛选稳定高表达两个基因的细胞（im PSCs），qRT⁃PCR和Western bolt方法检测表达水平；CCK8法、核型分析、免疫荧光、体内成瘤实验检测im PSCs生长曲线，染色体数目，胶原基质蛋白表达和有无恶性表型转化；共培养方法、CCK8法、细胞划痕、迁移侵袭方法检测imPSCs促瘤作用。

结果hPSCs呈多角形和梭形，慢病毒感染的im PSCs，显微镜下有亮绿色荧光；im PSCs细胞高表达SV40LT基因和hTERT基因；im PSCs生长曲线呈典型的“S”型，染色体数目增多，体内不能成瘤，表达α⁃SMA、Collagen I、Fibronectin，具有PSCs的生物学功能和特点；其与胰腺癌细胞共培养后，明显促进肿瘤生长，与人原代PSCs功能相当。

结论采用慢病毒转染SV40LT基因和hTERT基因可成功构建人胰腺星形细胞永生化细胞系，为胰腺星形细胞本身及胰腺癌微环境相关研究提供实验材料和模型。

［关键词］胰腺癌；胰腺星形细胞；永生化细胞系doi：10.3969/j.issn.1009⁃976X.2021.01.007中图分类号：R735.9文献标识码：AConstruction and functional verification of immortalized human pancreatic stellate cellsHAN Shi⁃ji1，2，LIAN Guo⁃da1，2，CHEN Shao⁃jie1，2，HUANG Kai⁃hong1，2*，LI Jia⁃jia1，3*1.Key Laboratory of Epidemiology and Gene Regulation of Malignant Tumors，Sun Yat⁃sen MemorialHospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；2.Department of Digestive System Depart⁃ment，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，China；3.Depart⁃ment of Nephropathy Department，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou510120，ChinaCorresponding author：HUANG Kai⁃hong，*****************；LI Jia⁃jia，****************［Abstract］Objective To construct the human pancreatic stellate cell line immortalization anddiscuss their biological function.Methods We extracted human primary pancreatic stellate cells（hPSCs）by outgrowth and then infected the cells with SV40LT and hTERT genes using lentivirus infection.Thecells（named imPSCs）with stable and high expression of SV40LT and hTERT genes were screened with puromycin.The next，qRT⁃PCR and Western Bolt methods were used to detect the expression levelsof the two K8method，karyotype analysis and immunofluorescence method were conducted respectively to detect the growth curve，chromosome number，protein expression ofα⁃SMA，collagen Iand fibronectin of the imPSCs.We also performed tumor formation assay in vivo to detect whether theimPSCs had malignant phenotypic transformation.The tumorigenesis of imPSCs was detected by transwellcell co⁃culture，CCK8methods，wound healing assay，migration and invasion methods.Results Humanprimary PSCs were polygonal and spindle shaped，and bright green fluorescence was observed under the microscope after successfully infected lentivirus.In imPSCs，SV40LT and hTERT genes were stably andhighly expressed in mRNA and protein levels.The imPSCs had typed“S”growth curve and increased基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（82003175）；广东省医学科学技术研究基金项目（A2019447）作者单位：1.中山大学孙逸仙纪念医院，广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，广州510120；2.中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广州510120；3.中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广州，510120*通讯作者：黄开红，Email：*****************；李佳佳，Email：****************胰腺癌恶性程度高，肿瘤间质纤维化是其重要病理特征，纤维化程度与不良预后相关［1］。

生物学的实验技术生物学是一门基础科学，通过实验技术的应用来探索和研究生物的结构、功能和相互关系。

在生物学实验中，实验技术的选择和运用对于实验结果的准确性和可靠性都起着至关重要的作用。

本文将介绍一些常用的生物学实验技术，以及它们在不同领域中的应用。

一、细胞培养技术细胞培养是生物学研究中广泛应用的一项技术。

通过细胞培养，可以观察和研究细胞的生命周期、生长特性和相互作用等。

在细胞培养中，我们需要准备培养基和培养器具，以及细胞的来源和处理方法。

常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系的建立。

1. 原代细胞培养原代细胞培养是指从组织中直接提取并培养的细胞。

它可以为后续的实验提供原始的细胞材料。

在原代细胞培养中，我们需要先对组织进行消化和分离，然后将细胞置于含有适当培养基的培养皿中。

定期更换培养基可以确保细胞的生长和扩增。

2. 细胞系的建立细胞系是从原代细胞培养中建立起来的，可以连续、稳定地传代的细胞群。

建立细胞系的关键是细胞的转染和选择。

常见的转染方法包括转染质粒、病毒和RNA干扰等。

通过筛选和鉴定，可以获得具有特定性状或功能的细胞系，为后续的实验提供可靠的细胞模型。

二、分子生物学技术分子生物学技术是用于研究生物分子结构、功能及其相互关系的一系列实验技术。

它们广泛应用于基因组学、转录组学和蛋白质组学等领域的研究。

1. PCRPCR（聚合酶链反应）是一种通过体外扩增DNA片段的技术。

它具有高度特异性和灵敏性，可以在短时间内扩增目标DNA序列。

在PCR实验中，我们需要设计引物、选择合适的酶和缩合剂，并进行反应体系的优化。

PCR在基因检测、基因克隆和疾病诊断等方面有广泛的应用。

2. 基因测序基因测序是确定DNA序列的过程，它对于理解遗传信息和基因功能至关重要。

目前常用的测序技术包括Sanger测序和高通量测序。

在测序实验中，首先需要提取DNA样品并进行文库构建，然后使用测序仪器进行序列反应和信号测量，最后通过数据分析和序列比对来获得DNA的序列信息。