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Ｈ9ｃ2心肌细胞多巴胺受体的表达摘要：为明确H9c2心肌细胞是否能够表达多巴胺受体(dopamine receptor,DR)，应用RT-PCR和Western blot-ting分别检测H9c2心肌细胞和SD成年雌鼠左心室心肌组织中，DR的两种亚型，D1DR和D4DR的表达，结果发现，H9c2心肌细胞可在mRNA和蛋白水平上表达出与SD大鼠心肌组织相同的产物，这说明能以H9c2心肌细胞为研究材料，进一步深入研究心肌DlDR和D4DR基因的表达调控机制以及心肌DR的功能。
关键词：多巴胺受体；心肌细胞；表达多巴胺受体(dopamine receptor，DR)为7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族的成员，属于视紫红质类家族，目前已分离出5种DR，根据生化和药理学特性，可分为D1样和D2样受体，Dl样受体包括D1DR和D5DR两种亚型，可激活腺苷酸-环化酶－cAMP-蛋白激酶A途径；D2样受体包括D2DR、D3DR、D4DR 3种亚型，与D1样受体的作用相反，抑制上述信息途径的活化，DR广泛分布于中枢神经系统及外周多种组织，如人和大鼠心肌及冠脉均已检测到DR的表达，据本室研究报道，与假手术组比较，去势大鼠心肌D1DR和D4DR的转录表达水平发生显著改变，本研究拟采用RT-PCR和Western blotting技术，检测大鼠心肌细胞系H9c2和SD大鼠左心室心肌组织内，D1DR和D4DR的mRNA和蛋白的表达。
1材料与方法1.1材料大鼠胚胎心脏来源的细胞株H9c2购自American type culture collection公司，DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO公司，青链霉素购自Sigma公司，Trizol 购自美国Invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒购自Promega公司，兔抗大鼠D4DR 多克隆抗体购自Calbiochem公司，羊抗大鼠D1DR多克隆抗体、抗actin抗体以及HRP-标记的二抗均购自Santa cruz公司，Ecl WesternBlotting检测试剂盒购自Amersham公司。
基于转录组学和HDAC2慢病毒过表达载体探究附子治疗心肌肥大的分子机制尹彦棚;谢晓芳;曹小玉;李刚敏;陈俊仁;高继海;彭成【期刊名称】《中药与临床》【年(卷),期】2022(13)3【摘要】目的:探究附子治疗心肌肥大体外细胞模型的分子机制。
方法:通过慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro-HDAC2转染H9C2心肌细胞建立稳定表达外源性HDAC2基因的体外心肌肥大模型。
采用qRT-PCR检测转染后的H9C2细胞中HDAC2mRNA水平,WB检测ANP以及BNP蛋白表达水平;选用附子水溶性生物碱以及水煎液对建立的体外心肌肥大模型进行给药处理,最后采用转录组学解析附子对其治疗的分子机制。
结果:与对照组相比,重组慢病毒组中细胞的HDAC2 mRNA水平相对表达量显著升高(P<0.05)。
转染后H9C2细胞表面积显著增加(P<0.05),ANP和BNP蛋白的表达水平也显著提高(P<0.05)。
表明HDAC2上调表达可能影响H9C2细胞表面积的增加和心肌肥大标志物的重新表达,心肌肥大体外模型构建成功。
转录组分析显示附子主要通过激活ABC transporters和PI3K-Akt信号通路,抑制mTOR、JAKSTAT、MAPK、TNF、Calcium、Wnt、Ras以及p53等信号通路基因的表达从而缓解心肌肥大症状。
结论:附子治疗心肌肥大的分子机制可能主要通过激活ATP转运体基因表达调控线粒体功能障碍,抑制钙离子信号、细胞生长、细胞凋亡和炎症反应等通路基因。
【总页数】7页(P46-52)【作者】尹彦棚;谢晓芳;曹小玉;李刚敏;陈俊仁;高继海;彭成【作者单位】西南特色中药资源国家重点实验室成都中医药大学【正文语种】中文【中图分类】R285【相关文献】1.基于瘤胃转录组探究双峰驼沙漠适应性分子机制2.基于唾液转录组学探讨慢性胃炎和胃癌脾虚证的分子机制3.利用转录组学和蛋白质组学技术揭示小麦抗旱分子机制的研究进展4.基于转录组学和代谢组学研究调控驴背最长肌嫩度的分子机制5.基于转录组测序探究乌鳢皮肤白化的分子机制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CRP基因沉默后心肌细胞系H9c2的miR-21及其靶基因表达、细胞活力观察程玲慧;余丽霞;叶凤英;权磊;谭文【摘要】目的观察沉默炎症因子CRP基因对H9c2心肌细胞活力的影响,并探讨其机制.方法①取H9c2心肌细胞,随机分为CRP沉默组和对照组.CRP沉默组转染对CRP特异性沉默的pLV-shRNA-CRP慢病毒,对照组转染无敲减作用的pLV-shRNA-Scramble慢病毒.筛选与鉴定慢病毒载体成功转染H9c2心肌细胞.转染48 h后,采用实时定量PCR法观察两组H-19c2心肌细胞CRP基因的沉默效率、miR-21及PDCD4、PTEN、Spry1 mRNA.②取H9c2心肌细胞,随机分为空白组、对照组和CRP沉默组,空白组不转染病毒加入等量的DMEM培养基,对照组转染pLV-shRNA-Scramble慢病毒颗粒,CRP沉默组转染pLV-shRNA-CRP慢病毒颗粒.转染24h后,采用MTT法检测三组H9c2心肌细胞活力.结果①CRP沉默组和对照组H9c2心肌细胞中CRP mRNA相对表达量分别为0.320±0.069、1±0.090,miR-21相对表达量分别为0.740±0.099、0.280±0.010,两组相比P均＜0.01.CRP沉默组PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达均低于对照组(P均＜0.01).②CRP沉默组、对照组和空白组细胞活力分别为0.78±0.030、0.66 +0.010、1.00±0.013;与空白组相比,CRP沉默组和对照组细胞活力均下降(P均＜0.01);与对照组相比,CRP沉默组细胞活力上升(P＜0.05).结论沉默CRP基因可促进H9c2心肌细胞存活,这可能与其可增加H9c2心肌细胞中miR-21表达,抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表达有关.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2018(058)040【总页数】5页(P1-5)【关键词】缺血性心脏病;心肌细胞;微小RNA-21;PDCD4基因;PTEN基因;Spry1基因;基因沉默;C反应蛋白【作者】程玲慧;余丽霞;叶凤英;权磊;谭文【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;华南理工大学医学院;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;广东工业大学生物医药研究院【正文语种】中文【中图分类】R541缺血性心脏病是全世界致死率最高的疾病之一[1]。
大鼠心肌细胞H9C2细胞描述：大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。
当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。
此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。
由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。
大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。
请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。
货号规格培养基运输保存C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存质量控制：本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。
培养条件：37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。
用途：本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。
细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作）收到复苏好的贴壁细胞的处理方法：1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜；2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉；3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时；4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基；5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜；6. 第二天传代。
收到冻存细胞的处理方法：1.37°C水浴预热培养基；2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)；6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
稳定过表达细胞株的鉴定
鉴定稳定过表达细胞株是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
通常，稳定过表达细胞株被构建来表达外源基因，这些基因可以编码蛋白质、RNA或其他生物分子。
在构建过程中，细胞株被转染并在筛选过程中选出表达外源基因的细胞株。
然而，仅仅检测外源基因的表达并不足以证明细胞株是稳定的。
为了鉴定稳定过表达细胞株，需要进行以下步骤：
1. 稳定性测试：通过连续培养稳定过表达细胞株多代，观察外源基因表达是否稳定。
通常，细胞株需要在稳定条件下培养至少20代，以确保表达稳定。
2. 比较分析：与野生型细胞株进行比较分析，例如测量细胞增殖速率、形态学、细胞周期等。
如果稳定过表达细胞株与野生型细胞株存在显著差异，则该细胞株可能存在异常。
3. 稳定性标记：将可观察的标记或标签引入到外源基因表达系统中，以确定细胞株是否稳定。
例如，可以将荧光蛋白或其他荧光标记引入到外源基因中，观察标记的表达是否稳定。
通过以上步骤鉴定稳定过表达细胞株，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
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Notch1胞内结构域真核表达质粒构建及在H9c2心肌样细胞的表达和生物学功能周学亮;万力;刘季春【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2013(23)10【摘要】目的构建Notch 1胞内结构域(N1ICD)真核表达质粒,确定能在H9c2心肌样细胞内表达,并发挥生物学效应,为后续Notch1信号通路的研究提供实验依据.方法设计并合成1对含有BamH Ⅰ和EcoR I酶切位点的特异性引物,以小鼠cDNA文库为模板,经PCR扩增得到了1 122 bp的目的片段,定向克隆至pcDNA 3.1/myc-His质粒,构建pcDNA3.1/N1ICD-myc-His真核表达质粒.通过双酶切及基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,48 h后提总蛋白,Western-blotting检测myc和Hes1,确定N1ICD能在H9c2细胞表达,并启动下游基因表达.结果表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His双酶切及基因测序正确,N1ICD可在H9c2心肌样细胞内高效表达,具有Notch1生物学效应.结论真核表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His构建成功,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础.【总页数】4页(P1-4)【作者】周学亮;万力;刘季春【作者单位】南昌大学第一附属医院心脏外科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院心脏外科,江西南昌330006;南昌大学第一附属医院心脏外科,江西南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.Notch1胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定 [J], 李明华;张芳婷;高书颖;于洁2.Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建 [J], 周学亮;刘季春3.Notch1-NICD胞内结构域真核表达载体的构建及其初步功能分析 [J], 巩天晓;刘红涛;鲁照明;许培荣;薛乐勋4.稳定表达 Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定 [J], 邹斌;吴霞;周学亮;詹宇亮;赖松青;刘季春5.甲型流感病毒M_2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析 [J], 王丰平;李明远;李燕;张卫东;李虹;蒋忠华;李婉宜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定许淑文;李艳;李继强;戴雯【摘要】Objective To construct and identify rat cardiomyocyte H9c2 cell line with stable and high expres-sion of transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Methods Plasmid pEGFP-TGF-β1 was extracted by RNA interfer-ence, and sequenced by ABI3130 Genetic Analyzer for identification. The identified pEGFP-TGF-β1 were then transfect-ed into rat cardiomyocyteH9c2 cell line (pEGFP-TGF-β1 group). After screening culture by G418, the expression of TGF-β1 was verifi ed by RT-PCR and Western blot. The cells transfected withempty control plasmid pEGFP were used as the control group. Results The sequencing results confirmed that pEGFP-TGF-β1 extracted contained TGF-β1 se-quence. The transfection efficiency of pEGFP-TGF-β 1 group and control group were 85% and 93%, respectively. RT-PCR showed that TGF-β1 mRNA expression level was (2.563 ± 0.198) in pEGFP-TGF-β1 group, which was signifi-cantly higher than (1.037±0.022) in control group (t=3.056, P=0.028). Western blot revealed that TGF-β1 protein expres-sion level was (3.275 ± 0.234) in pEGFP-TGF-β1 group, which was significantly higher than (1.011 ± 0.015) in control group(t=4.372, P=0.015). Conclusion The constructed rat cardiomyocyte H9c2 cell line could stably express TGF-β1 at high level, which could be used for our further research regarding the role of TGF-β1 in rat cardiomyocyte and the re-lated signaling pathway.%目的构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株.方法利用RNA干扰技术提取pEGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了pEGFP-TGF-β1质粒和pEGFP对照质粒的细胞株分为pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组.结果 pEGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%.RT-PCR结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1 mRNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015).结论本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2017(028)011【总页数】4页(P1721-1724)【关键词】大鼠心肌细胞;H9c2细胞株;转化生长因子-β1;质粒【作者】许淑文;李艳;李继强;戴雯【作者单位】武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060;武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060;武汉市第一医院神经外科,湖北武汉 430022;武汉大学人民医院检验科,湖北武汉 430060【正文语种】中文【中图分类】R-332转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是在心衰过程中急剧增加的重要细胞因子，它是一种调控细胞生长的关键细胞因子，参与调节免疫、细胞增殖与凋亡、创伤修复、胚胎发生和造血调控[1]。
h9c2 基因组H9C2基因组是一种常用的小鼠心肌细胞株系，广泛应用于心脏疾病的研究中。
本文将从H9C2基因组的特点、研究应用和未来发展等方面进行阐述。
一、H9C2基因组的特点H9C2基因组是小鼠心肌细胞系，具有以下几个主要特点：1.1 稳定性：H9C2细胞具有较高的稳定性，可以长期传代培养，并且细胞形态和功能相对稳定，适合进行长期的实验观察。
1.2 心肌样特性：H9C2细胞在形态和功能上表现出类似于心肌细胞的特点，包括细胞形态的梭形、心肌标志物的表达以及收缩蛋白的存在等。
1.3 容易培养：H9C2细胞对培养条件要求相对较低，能够在常规的细胞培养基中快速生长和增殖。
二、H9C2基因组的研究应用H9C2基因组在心脏疾病的研究中具有广泛的应用价值，主要包括以下几个方面：2.1 心肌细胞模型：H9C2基因组可以作为研究心脏疾病的细胞模型，通过模拟心肌细胞的生理和病理过程，探索心脏疾病的发病机制和药物治疗的效果。
2.2 药物筛选：利用H9C2基因组可以进行药物的筛选，评估药物对心肌细胞的毒性和保护作用，为临床药物研发提供重要的参考。
2.3 基因功能研究：通过基因敲除、过表达等技术手段，可以对H9C2基因组进行基因功能的研究，揭示心脏发育和疾病相关基因的作用机制。
2.4 病理生理研究：H9C2基因组可以用于研究心脏疾病的病理生理过程，如心肌细胞凋亡、氧化应激等，为心脏疾病的诊断和治疗提供新的思路。
三、H9C2基因组的未来发展随着科学技术的不断进步，H9C2基因组在心脏疾病研究中的应用还有很大的发展空间。
3.1 三维培养：传统的二维培养方式限制了细胞的生长和发育，未来可以尝试将H9C2基因组进行三维培养，更好地模拟心肌组织的结构和功能。
3.2 基因编辑技术：CRISPR/Cas9等基因编辑技术的广泛应用为H9C2基因组的研究提供了新的手段，可以精确地编辑和调控特定基因，加深对心脏疾病发生机制的理解。
3.3 多组学研究：结合转录组学、蛋白质组学等多组学技术，全面地研究H9C2基因组在心脏疾病中的变化规律，为心脏疾病的诊断和治疗提供更准确的依据。
h9c2细胞传代方法（原创实用版1篇）目录（篇1）1.引言2.h9c2 细胞的特点3.h9c2 细胞传代的必要性4.h9c2 细胞传代方法的具体操作步骤5.h9c2 细胞传代过程中的注意事项6.结语正文（篇1）一、引言h9c2 细胞系是一种来源于人胚肺组织的细胞系，具有较高的增殖能力和较强的分化潜能，被广泛应用于生物医学研究领域，如细胞生物学、药理学和毒理学等。
在使用 h9c2 细胞进行实验时，细胞传代是一项重要的技术手段，对于维持细胞活力和保证实验结果的可靠性具有重要意义。
本文将介绍 h9c2 细胞传代的方法及其操作注意事项。
二、h9c2 细胞的特点h9c2 细胞具有以下特点：1.贴壁生长：h9c2 细胞需要在培养皿中贴壁生长，不能悬浮生长。
2.较快的增殖速度：h9c2 细胞在适宜的培养条件下，具有较高的增殖速度。
3.分化潜能：h9c2 细胞具有较强的分化潜能，可向多种细胞类型分化。
三、h9c2 细胞传代的必要性细胞传代是指将原代细胞培养至一定密度后，用酶解法或机械法将细胞从培养皿中分离出来，再种植到新的培养皿中，以维持细胞生长和增殖的过程。
对于 h9c2 细胞而言，传代是为了保持细胞活力，防止细胞衰老和死亡，同时也是为了获取足够数量的细胞用于实验。
四、h9c2 细胞传代方法的具体操作步骤1.细胞密度的测定：使用细胞计数室对细胞进行计数，以确定细胞密度。
2.细胞分离：使用 0.25% 胰蛋白酶或胶原蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，注意不要破坏细胞结构。
3.培养皿准备：将新的培养皿加入适量的培养基，然后将分离出的细胞种植到新的培养皿中。
4.培养条件：将培养皿放入 37℃、5% CO2 的培养箱中，保持适当的湿度和气体环境。
5.观察细胞生长情况：定期观察细胞生长情况，观察细胞贴壁生长是否良好。
五、h9c2 细胞传代过程中的注意事项1.细胞密度的控制：细胞密度过高或过低都会影响细胞传代的效果，因此在传代过程中需要控制合适的细胞密度。
中的作用提供细胞模型。
方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。
结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。
结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。
【关键词】核仁素；H9C2细胞；基因转染
Abstract Objective:To establish H9C2 cell line that can stably express the nucleolin,whi ch can provide a cell line with which we can analyze the function of nucleolin in apopto sis of cardiomyocytes.Methods:The pCMV-Tag2B-Nuc plasmid was transfected into H9C2 cells with lipofectin,the stable transfectants screened by G418 and the expression of nucleo lin was identified and analyzed by RT-PCR and Western blot.The pCMV-Tag2B-Nuc plas mid was confirmed by double-enzyme digestion and sequencing.Results:After G418 screeni ng, compared with the control group,the mRNA and protein of nucleolin in transfected cel l line were highly expressed, as demonstrated by the RT-PCR and Western blot analysis.C onclusion:The rat H9C2 cell line stably expressing nucleolin was successfully constructed.
Key words Nucleolin; H9C2 cell line; Gene transfection
近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生发展与细胞增殖和凋亡有关。
细胞凋亡的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。
核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。
另有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。
因此，本研
用提供理想的细胞模型。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒pCMV-Tag2B-Nuc由德国Hamburg-Eppe大学细胞生物化学与临床神经生物学研究所Stefan Kindler教授惠赠；H9C2细胞株由中南大学细胞中心提供；DMEM培养基，Gibc o公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invit rogen life technologies公司产。
鼠抗C23单克隆抗体，Santa Cruz公司产；质粒抽提试剂盒，大连TaKaRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，Gibco BRL公司产。
1.2. H9C2细胞培养
大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。
3 质粒扩增、抽提及鉴定
质粒转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆进行扩增；质粒抽提依试剂盒说明书进行；用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒，一部分1％琼脂糖胶电泳，拍照；另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。
1.4 脂质体转染
根据生命技术公司提供的转染操作说明书进行。
细胞用无血清DMEM培基洗涤3次后，加入质粒与脂质体的混合物，37 ℃，5%的CO2培养箱中培养，6 h后再加入4 mL含10%小牛血清的DMEM培基，24 h后，按1∶10进行分瓶培养。
第2 d加入含1 000 μg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选4周。
同时转染pCMV-Tag2B空载体，用G418进行同样筛选后用于对照。
1.5 免疫印迹
按实验室常规方法进行。
用2×SDS裂解缓冲液裂解细胞，收集细胞总蛋白质，采用Bra dford法进行蛋白定量，30 μg蛋白经10%～12% SDS-PAGE电泳6 h后，电转（4 ℃，过夜）至PVDF膜，2%BSA室温封闭3 h，先后加入靶蛋白抗体及HRP标记的相应IgG，室温分别孵育1 h和0.5 h，DAB显色试剂盒进行显色。
1.6 细胞总RNA提取
按实验室常规方法进行。
弃培养液，加1 mL Trizol/2×106细胞，裂解细胞，细胞裂解物转移到2 mL Eppdorf管中，室温放置5 min，加0.2 mL氯仿/1 mL Trizol，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，4 ℃离心，细胞裂解液分为三层，小心吸取上层水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，加0.5 mL异丙醇/1 mL Trizol，室温放置10 min，4 ℃离心，小心去掉上清，加1 mL 75％乙醇洗白色沉淀物，离心后去掉乙醇，空气干燥约10 min，用10 μL～20 μL DEPC处理过的水重悬RNA，测量1∶100稀释样品的光密度（OD260）来计算浓度。
浓度（μg/mL）=(稀释度)［（40 μg/mL.OD260）］(样品的OD260)，重悬的RNA放置-80℃冰箱保存。
1.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
用逆转录酶MMLV合成第一链。
根据公司提供的使用说明书进行。
取1 μg RNA与oli gDT在70℃反应5 min，置于冰上，加入dNTP、buffer、Rnasin，37 ℃反应5 min后置
于冰上；加入MMLV，42℃反应1 h，72 ℃反应10min。
用2.5 μL的逆转录产物作为模板，按如下的反应条件进行PCR扩增：
C23：F:cgcggatcccatggtgaagctcgc；B：cggggtacctattcaaacttcgtcttct
94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，扩增31个循环；
GAPDH：F：acccagaagactgtggatgg B：ttctagacggcaggtcaggt
94 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，扩增22个循环。
2 结果
2.1 质粒鉴定
质粒pCMV-Tag2B-Nuc经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，产物在一部分1％琼脂糖胶电泳，另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。
将未经酶切质粒与质粒酶切产物均行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
酶切产物出现约2.1 kb大小片段，大小与预期一致。
测序结果与GenBank中公布的序列符合（测序结果未展示）。
2.2. 核仁素mRNA在H9C2细胞中的表达
以细胞的总RNA为模版，以特异性的引物经RT-PCR扩增出大小约为2.1 kb的片段，其长度与预期一致(见图2)，稳定表达核仁素的H9C2细胞RNA表达水平较野生型与转空载体细胞明显增高，以GAPDH作为内对照。
2.3. 核仁素在H9C2细胞中的表达
经Western blot检测，转pCMV-Tag2B-Nuc细胞与野生型细胞和转空载体细胞相比，核仁素表达水平明显升高(见图3)。
3 讨论
细胞凋亡在生物体的胚胎发育、器官形成等生理状态，以及神经退形性变、肿瘤发生、脑梗死、心衰等病理过程中均起重要作用［４］。
作为一种定位于核仁的磷酸蛋白，核仁素在细胞凋亡中的作用一度被忽视，但随着其功能的不断发掘，核仁素在细胞凋亡中的作用越来越突出，已被列为细胞凋亡相关蛋白中的一员［２。
