番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

北京农学院学报２０１６，３１（４）：２６—３０　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｈｔｔｐ：／／ｂｎｘｂ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ　

ｄｏｉ：１０．１３４７３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ．１００２—３１８６．２０１６．０４０６　

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与ＲＮＡｉ　植物表达载体的构建　

吴巧玲，任晓平，张喜春　（北京农学院植物科学技术学院，北京１０２２０６）　

摘要：【目的】克隆了脯氨酸脱氢酶ＰｒｏＤＨ基因的全长ｃＤＮＡ，构建了ＰｒｏＤＨ基因的ＲＮＡ干扰植物表达载　体，并转化到农杆菌。【方法】以“耐运２０００番茄”幼苗为试材，根据ＧｅｎＢａｎ中公布的番茄脯氨酸脱氢酶　ＰｒｏＤＨ基因的序列信息没计了一对特异性引物，克隆了该基因的全长ｃＤＮＡ，分析基因序列选择正反向片段并　扩增，并通过酶切、连接的方法构建了ＰｒｏＤＨ基因的ＲＮＡ干扰植物表达载体ＰＢＩ１２１一ＰＤＨｉ；利用冻融法将　表达载体转化到农杆菌ＥＨＡ１０５中。【结果】所克隆到的Ｐｒ０ＤＨ基因片段长２　０¨。ｌ　ｂｐ，其中ＣＤＳ为１　４９１　ｂｐ，　编码３８０个氨基酸。测序结果与公布序列同源性１００　，因此可以用来构建干扰载体；通过酶切与测序鉴定，证　明表达载体构建成功。【结论】经特异性引物扩增检测，证明表达载体已转入农杆菌，为进一步的研究该基因奠　定了基础。　关键词：番茄；ＰｒｏＤＨ；ＲＮＡ干扰；载体构建　中图分类号：￥６４１．２　文章编号：１００２—３１８６（２０１６）０４—００２６—０５　文献标志码：Ａ　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡｉ　ｖｅｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｏｍａｔｏ　ＷＵ　Ｑｉａｏｌｉｎｇ，ＲＥＮ　Ｘｉａｏｐｉｎｇ．ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｃｈｕｎ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊ　ｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｂｅｉｊ　ｉｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊ　ｅｃｔｉｖｅｌＴｈｅ　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　Ｐｒｏｌｉｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＰｒｏＤＨ）ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ．Ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ　ｅｊａｃｉｅｎｓ．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］Ａｐａｉｒ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｂａｓｅ　ｏｆ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅｓ（ＰＢＩ１２１－ＰＤＨｉ）ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔＵＮｅｆｉｚｃｉｅｎｓ　ＥＨＡ１０５　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｒｅｅｚｅ　ｔｈａｗ　ｍｅｔｈｏｄ．［Ｒｅｓｕｌｔｓ］Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｗａｓ　２　００　１　ｂｐ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＣＤＳ　ｗａｓ　１　４９１　ｂｐ　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｄ　３８０　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｈａｒｅｄ　ａ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　１００　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒ　ｔｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰｒｏＤＨ　ｇｅｎｅ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｌ　Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｔｕｄｙ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｏｍａｔｏ；Ｐｒｏｌｉｎｅ　ｄ　＾　ｒ。ｇ　Ⅱ　ｇｅｎｅｎ（ＰｒｏＤＨ）；ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　

番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｒｎ）为茄科（Ｓｏ—　ｌａｎａｃｅａｅ）番茄属的一年生草本植物　。。　。番茄原产　于南美洲地区，已发展成为广泛分布于世界不同地　区的重要蔬菜作物　。植物在逆境胁迫下的生理　反应称为逆境生理　。对于抗寒性强的番茄品种，　温度低于１０℃时生长发育受阻，５℃时表现寒害症　

收稿日期：２０１６－０６—０６　基金项目：科技部国际合作项目（２０１１ＤＦＲ３１１８０）　第一作者：吴巧玲，女，硕士生，主要从事番茄遗传育种研究，Ｔｅｌ：０１０—８１　７９８０３９，Ｅ—ｍａｉ１：ｌｉｎｅａｒ１＠１６３．ｃｏｍ　通信作者：张喜春（１９６３　），男，教授，硕士生导师，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究，Ｔｅｌ：０１０—８ｌ７９８０３９，　Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｃｈｕｎｚｈａｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ　２０１６年第４期　吴巧玲等：番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与ＲＮＡｉ植物表达载体的构建　２７　状，生长完全停止［６］。探索植物抗寒性的生理机制　及其遗传因素，在解决生产实际问题上具有广泛的　应用价值　］。植物抗寒基因工程研究包括导入调控　功能基因和导人抗寒调控基因Ｅｓ］。植物体内脯氨酸　含量在干旱、低温、高盐等渗透胁迫下会增加　］。逆　境胁迫下植物体内的脯氨酸降解受到抑制口　。脯　氨酸的积累能有效降低细胞质水势，维持细胞内水　分平衡，从而起到保护的作用口　。植物体内脯氨酸　的含量在一定程度上可以反映植物对环境胁迫耐受　能力的强弱＿ｌ　。编码运输脯氨酸蛋白（ＰｒｏＴ）的基　因已经从拟南芥　¨］、水稻Ｅ１４３、番茄　、大麦　等作　物中克隆得到。　编码脯氨酸合成酶基因的研究较为深人，而在　植物中对番茄脯氨酸脱氢酶基因的研究较少，主要　在拟南芥、青花菜、甘蓝等植物中，对青花菜的　Ｐｒ０ＤＨ基因的ＲＮＡ沉默，能够有效的提高其对干　旱胁迫和盐胁迫的抗性［１　。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎ—　ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）可以高效地抑制特定基因的表　达，利用该技术可以有效地使目的基因沉默，所以作　为分析特定基因未知功能的ＲＮＡｉ技术已广泛应用　于植物基因工程的研究中。本试验旨在对番茄　ＰｒｏＤＨ基因进行克隆与ＲＮＡｉ载体的构建，为开　展ＰｒｏＤＨ基因的表达抑制、功能等研究打下基础，　通过基因沉默提高番茄的耐寒性。　１　材料与方法　１．１　材料　材料为番茄４４号保存品种、中间载体ＨＭｗ—　Ｉｎｔ和表达载体ｐＢＩ１２１、根癌农杆菌菌株ＥＨＡ１０５　由北京农学院蔬菜遗传育种与生物技术实验室。　ｐＭＤ１９－Ｔ克隆载体试剂盒为ＴａＫａＲａ公司产　品；大肠杆菌感受态ＤＨ５ａ购自北京天根公司。　ＥＡＳＹｓｐｉｎ植物ＲＮＡ快速提取试剂盒、ＲＮＡ　清洁纯化试剂盒、高纯度质粒小量快速提取试剂盒、　琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒均为北京Ａｉｄｌａｂ公司　产品；ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶及各　种限制性内切酶均为ＴａＫａＲａ公司产品；利福平　（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，Ｒｉｆ）、卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋｍ）、氨　苄青霉素（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｕｍ，Ａｍｐ）、Ｘ—Ｇａｌ、ＩＰＴＧ为　Ｓｉｇｍａ公司产品。　引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司　（北京部）完成。　１．２试验方法　１．２．１　番茄ＰｒｏＤＨ基因的克隆按照ＥＡＳＹｓｐｉｎ　植物ＲＮＡ快速提取试剂盒（Ａｉｄｌａｂ公司）说明书提　取番茄叶片的总ＲＮＡ，并用ＤＮＡ酶Ｉ消化处理，　纯化回收。测Ａ２６０／２８０值，并用琼脂糖凝胶电泳　鉴定ＲＮＡ的质量，一８Ｏ℃保存。用Ｍ—ＭＬＶ反转　录酶（ＴａＫａＲａ公司）对总ＲＮＡ进行反转录，获得　ｃＤＮＡ，一２０℃保存备用。参照ＰｒｏＤＨ基因（Ｇｅｌ１一　Ｂａｎ登录号为ＢＴ０１２７３５）的序列设计特异性引物。　上游引物为：５’～ＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧＣＣＧ一３，，　下游引物为：５’一ＴＡＧＴＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＣＴＣ一　３’，由上海生工生物技术有限公司北京合成部合成。　以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，以无菌水为模板　做阴性对照。扩增产物在１　的琼脂糖凝胶上电泳　检测并回收。将目的片段与Ｔ载体（ｐＭＤ　１９一Ｔ）连　接。将连接产物加入ＤＨ５ａ感受态细胞中，菌液涂　布并挑取平板上的白色单克隆，做菌落ＰＣＲ阳性鉴　定。将检测正确的阳性克隆送去上海生工生物有技　术限公司进行测序，由于片段较长，进行双向测序，　拼接。将测序结果与ＧｅｎＢａｎ中注册的番茄　ＰｒｏＤＨ基因进行同源性比较。　１．２．２番茄ＰｒｏＤＨ基因ＲＮＡｉ表达我体的构建　利用ＤＮＡｍａｎ软件分析番茄ＰｒｏＤＨ基因的ＤＮＡ　序列，根据中间载体、表达载体和基因序列上的酶切　位点，在开放阅读框中选择了２４０　ｂｐ的ＣＤＳ序列　作为干扰目的片段，用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计含　有酶切位点的引物。为使反向重复序列能够插入表　达载体ＰＢＩ　１２１的多克隆位点，分别在正反向引物　中加入Ｓａｃ　Ｉ、ＢａｍＨ　Ｉ和Ｓｍａ　Ｉ、Ｂｇｌ　ＩＩ酶切位点和　相应的保护碱基。扩增反义片段引物为：５’。　ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧＡＣＡＧ一３’（含　Ｓａｃ　Ｉ酶切位点），５’＿ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴ—　ＧＡＡＡＧＣＣＣＡ一３’（含ＢａｍＨ　Ｉ酶切位点）；扩增正　义片段引物为：５’一ＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴ—　ＴＣＡＣＧＡＣＡＧ一３’（含Ｓｍａ　Ｉ酶切位点），５’一　ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＡＡ　ＴＧＡＡＡＧＣＣＣＡ一３’　（含Ｂｇｌ　ＩＩ酶切位点）。　以ｃＤＮＡ为模板，使用ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶分　别扩增正反义片段，以无菌水为模板做阴性对照。　将ＰＣＲ扩增产物电泳检测后回收目的片段，分别和　ｐＭＤ１９－Ｔ克隆载体连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受　态细胞。挑取单克隆，做菌落ＰＣＲ鉴定。鉴定为阳　性的菌液送去上海生工进行测序，将测序结果在　ＮＣＢＩ上通过ＢＬＡＳＴ进行同源性比对。将鉴定为　阳性的菌液用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取　正反义质粒，分别命名为Ｐｓ和Ｐａ。所得到的质粒