几种新型植物基因表达载体的构建方法
摘 要: 利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA
表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化 载 体
的 某 个 区 域 ； 构 建 多 片 段 复 杂 载 体 可 采 用 不 依 赖 序 列
和 连 接 的 克 隆 方 法 (Sequence and ligation-independent cloning,
SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这
6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词: Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法
基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年 Arber
等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表 达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
北方园艺
２０１３（
０５）：
８７
～９０·生物技术·
第一作者简介：
毛莹（
１９９１
－），
女，
在读硕士，
现主要从事植物资源
及生物技术等研究工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：
９３５４９７７２５＠
ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：
周嘉裕（
１９７６－），
女，
博士，
副教授，
现主要从事植物资源
及生物技术等研究工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：
ｓ
ｐｉｎｅｚｈｏｕ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｎ．
基金项目：
国家自然科学基金资助项目（
３１２７１３０２）；
教育部中央高
校基本科研业务费专项资金资助项目（
ＳＷＪＴＵ１１ＣＸ１１４）；
中国科
学院成都生物研究所山地生态恢复与生物资源利用重点实验室
及生态恢复与生物多样性保育四川省重点实验室开放课题资助
项目；
国家级大学生创新创业训练计划资助项目（
２０１２１０６１３０５０）；
西南交通大学科技发展计划资助项目（
２００８Ｂ０６）。
收稿日期：
２０１２－１１－０９川芎甜菜碱醛脱氢酶
ｃＤＮＡ的克隆及
其植物表达载体的构建
毛
莹
１，
张艳军
１，
王万军
１，
陈劲松
２，
廖
海
２，
周嘉裕
２
（
１．西南交通大学生命科学与工程学院，
四川成都
６１００３１；
２．中国科学院成都生物研究所，
四川成都
６１００４１）
摘
要：
以川芎为试材，
从叶片中提取总
ＲＮＡ，
经过
ＲＴ
－ＰＣＲ获得甜菜碱醛脱氢酶（
Ｂｅｔａｉｎｅ
ａｌｄｅｈ
ｙｄｅ ｄｅｈ
ｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ）
基因的
ｃＤＮＡ，
纯化后与
ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，
转化大肠杆菌
Ｔｏ
ｐ１０，
获得
甜菜碱醛脱氢酶全长基因序列，
以期构建植物表达载体。
结果表明：
甜菜碱醛脱氢酶全长核苷酸
长度为
１ ５２７ｂ
ｐ，
编码
５０８个氨基酸。
与
ＧｅｎＢａｎｋ中已发表序列
ＨＭ３５２７６进行比较，
核苷酸同源
性为
１００％。
将该基因片段克隆到植物表达载体
ｐＢＩ１２１中，
构建重组质粒
ｐＢＩ１２１／
Ｂｅｔａｉｎｅ ａｌｄｅ－
ｈ
ｙｄｅ ｄｅｈ
ｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ，
并将所获重组质粒经过双酶切和
ＰＣＲ处理后进行序列测定，
证实表达载体
上含有目的片段，
且连接、
构建正确，
为
ＢＡＤＨ的进一步表达奠定了基础。
天津农业科学 删ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１１，１７（１）：５０－５４
・植物生理与生物技术
蚯蚓ＭＴ基因植物表达载体的构建及烟草转化
黎亚丽，李继刚，刘兰芳 （河北大学生命科学学院，河北保定０７１００２）
摘要：为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力，从而减少重金属对土壤的污染，本研究将克隆的赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａ）ＭＴ基因，装人植物表达载体ｐＰＺＰ１１１，构建了植物表达载体ｐＰＺＰ—ｅｆＭＴ。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌ＥＨＡ１０５ 中，通过叶盘法转化烟草。经ＰＣＲ检测，ｅｆＭｒ￣ｔ已整合到烟草基因组中，为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了 基础。 关键词：ＭＴ基因；表达载体构建；根瘤农杆菌；烟草转化 中图分类号：Ｑ７８２ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ编码：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－６５００．２０１１．０１．０１３
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｔｏｂａｃｃｏ
ＬＩ Ｙａ－ｌｉ．ＬＩ Ｊｉ—ｇａｎｇ．ＵＵ Ｌａｎ—ｆａｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ，ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ ｏｆ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ，ｔｈｅ Ｅｉｓｅｎｉａｆｏｅｔｉｄａ ＭＴ ｇｅｎｅ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐＰＺＰ－ｅｆＭＴ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＥＨＡ１０５ ｂｙ ｔｒｉｐｒｅｎｔａｌ ｃｒｏｓｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｂｙ ｌｅａｆ—ｄｉｓｃ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏ— ｂａｃｃｏｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗｏｕｌｄ ｍａｋｅ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｎｔｉ－ｍｅｔａｌｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｃｉｎ ｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｔｏｂａｃｃｏ
新疆农业大学学报 ２０１３，３６（４）：２６５～２６８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
文章编号：１００７—８６１４（２０１３）０４—０２６５ ０４
抗除草剂ｂａ ｒ基因植物表达载体的构建与
孟灵真 ，陈全家 抗性功能的检测
，杨 婷 ，阿 依夏 木・古丽 。，王希东 。，曲延英 。
（１．新疆农业大学农学院，乌鲁木齐８３００５２；２．新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐８３００５２）
摘 要： 根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的抗除草剂ｂａｒ基因序列设计引物，通过高保真ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增，获得 ｂａｒ基因片段，连接在ｐＭＤ１８－Ｔ中间克隆载体上，用限制性内切酶Ｘｂａ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ酶切后连接到ｐＢＩ１２１上获得 ｐＢＩ１２１一ｂａｒ。用ＨｉｎｄⅢ内切酶切含Ｂｔ一４ＡＢ基因的质粒并与ｐＢＩ１２１一ｂａｒ重组，重组质粒命名为ｐＢＩ１２１一ｂａｒ／Ｂｔ。 重组质粒导入农杆菌ＬＢＡ４４０４工程菌中，转化新海２４号棉花胚性愈伤组织。ＰＰＴ抗性实验证明，构建的 ｐＢＩ１２１一ｂａｒ／Ｂｔ载体获得抗除草剂抗性，并筛选出ＰＰＴ临界筛选浓度为３．０ ｍｇ／Ｉ 。
关键词：抗除草剂；抗虫；双价植物表达载体；棉花；ＰＰＴ头孢霉索 中图分类号：Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｔｈｅ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂａｒ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｔ
Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ
ＭＥＮＧ Ｌｉｎｇ～ｚｈｅｎ ，ＣＨＥＮ Ｑｕａｎ－ｊｉａ ，ＹＡＮＧ Ｔｉｎｇ ，
Ａｙｉｘｉａｍｕ Ｇｕｌｉ ～．ＷＡＮＧ Ｘｉ—ｄｏｎｇ ．ＱＵ ｒａｎ—ｙｉｎｇ ，
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３００５２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ Ｌａｂ．ｏｆ
