下载文档原格式
F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化司爱君;祝建波;李吉莲;邓福军【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2008(017)005【摘要】类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3',5-'hydroxylase; F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素.从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA , 利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段.F3′5′H的 cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34 %,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸.将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6 %.将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上, 并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株.【总页数】5页(P306-309,329)【作者】司爱君;祝建波;李吉莲;邓福军【作者单位】石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;新疆农垦科学院,新疆石河子,832000;新疆农垦科学院,新疆石河子,832000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.根癌农杆菌介导反义F3'H基因对矮牵牛的遗传转化 [J], 刘南南;王宝琴;管宇2.矮牵牛F3＇5＇H基因的克隆及其在不同着色花药中的表达 [J], 花庆;王蕾;韦灵林;刘迎团;徐虹3.矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化 [J], 李莉;祁银燕;解燕;刘雅莉;娄倩4.国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化 [J], 许锋;朱俊;张风霞;王燕;程水源;程述汉5.中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究 [J], 汪阳东;李春秀;齐力旺;张守攻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物基因工程的一般步骤一、目的基因的获取在植物基因工程中，首先需要获取目的基因。
目的基因是指那些对植物性状具有重要影响的基因，通过改变这些基因的表达或功能，可以实现植物的遗传改良。
目的基因的获取通常采用分子克隆技术，从植物基因文库或通过PCR等技术直接从植物组织中克隆目的基因。
二、植物表达载体的构建获取目的基因后，需要构建一个植物表达载体。
植物表达载体是一种将目的基因转移到植物细胞内的质粒或病毒载体，通常包括启动子、终止子等调控元件，以及选择标记基因等。
构建植物表达载体的目的是为了确保目的基因在植物细胞内的正确表达。
三、将目的基因导入植物细胞构建好植物表达载体后，需要将其导入到植物细胞中。
导入方法通常采用基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法等。
这些方法各有优缺点，应根据目的基因和植物种类选择合适的方法。
四、目的基因整合到植物基因组中导入植物细胞后，目的基因需要整合到植物基因组中才能实现其功能。
这一过程通常需要采用分子生物学技术进行检测和鉴定，以确保目的基因已经正确地整合到植物基因组中。
五、目的基因的检测与鉴定为了确认目的基因是否已经表达以及表达水平如何，需要进行目的基因的检测与鉴定。
这一过程通常采用分子生物学技术，如PCR扩增、DNA测序、Northern blot、Western blot 等，对目的基因的表达进行检测和鉴定。
六、转基因植物的筛选与培育在目的基因成功整合到植物基因组中并表达后，需要筛选和培育转基因植物。
这一过程通常采用抗性筛选、分子检测等技术，对转基因植株进行多代选育，培育出遗传稳定性好、农艺性状优良的转基因植株。
七、转基因植物的遗传稳定性检测为了确保转基因植株的遗传稳定性，需要进行遗传稳定性检测。
这一过程包括对转基因植株的DNA进行多代跟踪分析，以评估目的基因的遗传稳定性及其对后代的影响。
八、转基因植物的安全性评估与环境释放在转基因植物培育成功后，需要进行安全性评估与环境释放。
番茄黄化曲叶病毒 Rep 基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化裴华丽;刘永光;乔宁;李美芹;薛其勤;杨天慧【摘要】克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因（TYLCV－Rep），并构建其植物表达载体，通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。
经过共培养、潮霉素筛选和分化再生，获得21株潮霉素抗性植株。
PCR检测和Southern Blot检测结果表明，有3株呈阳性检测反应，说明TYLCV－Rep基因已整合到番茄基因组中，阳性率为14．3％。
烟粉虱接种试验结果表明，番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。
【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P41-44,45)【关键词】复制酶基因;黄化曲叶病毒;番茄;遗传转化;表达载体【作者】裴华丽;刘永光;乔宁;李美芹;薛其勤;杨天慧【作者单位】潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700【正文语种】中文【中图分类】S436.412.1+1通信作者：刘永光，硕士，讲师，主要从事植物病理方面的研究。
E-mail：****************。
番茄在中国各蔬菜产区均有大面积的种植，在我国蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。
随着温室大棚的推广及蔬菜反季节栽培效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势。
近年来，在番茄主产区相继发现的番茄黄化曲叶病毒，对番茄植株的生长、开花、坐果等方面均产生严重的危害，给当地的番茄生产带来巨大的经济损失[1-6]。
番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)[4-7]，是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
betA-BADH双价基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐的遗传转化betA/BADH双价基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐的遗传转化引言：随着人类对于资源的需求不息增长和环境问题的日益突出，农作物的培育和改良迫在眉睫。
基因工程技术为农作物品种改良提供了一个新的途径。
本探究旨在构建betA/BADH双价基因植物表达载体，并将其应用于四倍体刺槐的遗传转化，以期提高该物种的耐旱能力和产量。
一、材料与方法1. 构建betA/BADH双价基因植物表达载体本探究使用了pCAMBIA1300载体进行基因的构建，该载体包含了CaMV 35S启动子和nos终止子，可广泛应用于植物基因工程探究。
起首，利用PCR技术将betA和BADH基因从模式植物中扩增得到。
随后，将扩增得到的这两个基因与pCAMBIA1300载体进行酶切毗连，形成betA/BADH双价基因植物表达载体。
2. 四倍体刺槐的遗传转化起首，选择健康的刺槐幼苗作为受体材料。
使用激素处理方法，获得愈伤组织。
将构建好的betA/BADH双价基因植物表达载体引入愈伤组织，通过生物转化方法将外源基因转入植物细胞。
接着，将转化后的愈伤组织进行再生培育，得到转基因幼苗。
将转基因幼苗移植到含有适合营养和激素的生长基质中，进行苗期管理。
最后，将转基因苗移植至田间，并进行长期的观察和鉴定。
二、结果与分析1. 构建了betA/BADH双价基因植物表达载体经酶切毗连，成功将betA和BADH基因与pCAMBIA1300载体进行了毗连，并得到到了目标载体。
2. 四倍体刺槐的遗传转化通过生物转化方法，将构建好的betA/BADH基因植物表达载体成功引入刺槐愈伤组织中，并得到了转化后的愈伤组织。
经过再生培育，转基因幼苗成功获得。
经过一系列的苗期管理，转基因苗良好地生长并逐渐适应田间条件。
三、谈论本探究成功构建了betA/BADH双价基因植物表达载体，并将其应用于四倍体刺槐的遗传转化。
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
