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几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年 Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
![一种植物表达载体及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/84cf120082c4bb4cf7ec4afe04a1b0717fd5b3c4.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.11.27C N 103409459 A(21)申请号 201310079547.0(22)申请日 2013.03.13C12N 15/82(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12N 1/21(2006.01)A01H 5/00(2006.01)(71)申请人天津大学地址300072 天津市南开区卫津路92号(72)发明人季静 王罡 吴疆 刁进进(74)专利代理机构天津市杰盈专利代理有限公司 12207代理人王小静(54)发明名称一种植物表达载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法和应用。
用PCR 的方法从出发表达载体pGreenII0229、pCAMBIA3300-35S-HAK 和pGH-X6145G 上克隆1#、2#、3#和4#片段。
用NotI 和MIUI 分别酶切1#和2#片段并连接得到载体pJWW-12；用XhoI 分别酶切pJWW-12和3#片段并连接得到载体pJWW-123；用SacI 分别酶切载体pJWW-123和4#片段并连接得到表达载体pJWW0230。
本发明可以方便地进行TA 克隆。
本发明载体可以方便快捷插入启动子和目的基因，启动子可通过简单的TA 克隆连接入载体，目的基因可通过一步克隆插入到本载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。
该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书7页序列表9页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页序列表9页 附图5页(10)申请公布号CN 103409459 A *CN103409459A*1/1页1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK ，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段分别为1#和2#片段，分别含有LB 和RB ；从pCAMBIA3300-35S-HAK 上克隆35S-NOS 片段为3#片段；以质粒pGH-X6145G 为模板克隆4#片段，最后将这4个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWW0230；其中，RB 位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB 位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；所述1#片段如序列SEQ ID NO ：1所示；所述2#片段如序列SEQ ID NO ：2所示；所述3#片段如序列SEQ ID NO ：3所示；所述RB 如序列SEQ ID NO ：4所示，所述LB 如序列SEQ ID NO ：5所示；所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO ：6所示；所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO ：7所示；连接4#片段测序结果如序列SEQ ID NO ：8所示。
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
构建基因表达载体的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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②载体选择与准备：根据表达系统（细菌、酵母、哺乳动物细胞等）和目的蛋白特性，选择合适的表达载体，如pET系列（原核）、pYES2（酵母）、pcDNA3.1（哺乳动物）。
载体需预先线性化或具有特定限制酶切位点。
③酶切与连接：使用限制性内切酶对目的基因片段和载体分别进行酶切，以产生相匹配的黏性末端或平末端。
之后，通过T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到载体上。
④转化与筛选：将连接产物转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌DH5α），通过热激、电击等方法促进细胞吸收DNA。
随后在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出含重组载体的阳性克隆。
⑤验证与测序：挑取阳性克隆，通过PCR、酶切分析或直接测序等方法验证目的基因是否正确插入载体，以及阅读框是否正确。
⑥表达验证：将验证后的重组载体转入最终的表达宿主细胞中，诱导表达目标蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot等方法检测蛋白的表达效率及特性。
基因表达载体构建实验方法基因表达载体构建实验目的较为官方的解释为：使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
通过这种手段，我们就可以将众多的目的基因进行异源性的表达，因此能够快速并且大量的富集到对应的目的蛋白；此外，我们还能够以农杆菌为目的基因的载体，通过植物侵染的方式，将目的基因转入到植物中，从而形成特殊的遗传材料，进行特定的课题研究。
基因表达载体构建实验原理通俗点来理解，就是我们将一个感兴趣的基因，通过一种手段将其放到一个表达载体上，这个表达载体一般为细菌细胞内特有的一种环状双链DNA分子，称为质粒。
将目标基因连接到质粒上之后，得到的就是一个人为拼接后的重组质粒，我们称之为表达载体。
接下来我们就可以通过转化的方法，将这个重组质粒转化到感受态细菌中，例如trans5α，DH5α，DB3101等等菌株中。
将转化成功的细菌克隆进行培养繁殖，得到的菌液就可以进行长时间冷冻保存了。
待需要使用时，只需要将菌种从-80℃取出，进行复苏并培养，然后进行质粒提取，就可以再次拿到大量的目的基因表达载体，供后续实验使用。
基因表达载体构建实验步骤设计引物，PCR扩增目的基因片段，切胶回收目的基因加A，体系：10 X easy buffer 1uldATP 0.8 ulTaq 酶 0.1ul回收产物 8ul72℃ 40minXcmI 酶切 En-ccdB （50ul）En-ccdB 质粒（200ng/ul） 50ul (1ug)10X NE buffer 50ulH2O 38ulXcmI 酶 2ul 10U37℃ 1h , 65℃ 20min热失活，跑胶回收（约2600bp）加A后的产物与酶切的pEntry-T 连接摩尔比1:1~5:1（10ul体系）加A的回收产物 ul酶切后的En-T ul5XT4 buffer 1ulT4 ligase 0.5 ulH2O 补齐22℃ 1h转化DH5α,涂LB固体培养基（kana），筛选阳性克隆后进行测序验证碱基序列。
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
1. 载体构建方法1.1 快速构建小片段基因表达载体基因产物克隆的方法有很多种，如共环消解法、T4 DNA 聚合酶回切产生粘端、外切核酸酶Ⅲ回切产生粘末端、PCR 产物非依赖连接克隆、TA 克隆等，这些方法原理不一，应用的方向也不相同，但都不适合小片段基因的克隆及其载体的构建[ 3 ]。
传统构建方法构建载体时需要PCR 扩增，用2个不同的限制性内切酶酶切PCR产物和载体，酶切后进行胶回收等，步骤繁琐、连接成功率低，任何一个步骤出现问题都会导致最终实验失败。
因此，提高酶切和连接的效率是提高实验成功率的关键。
通常在实际的实验中我们会将酶切后的片段进行回收浓缩，而且使用较小的连接体系，这种方法就利用了竞争性连接的特点，来源于化学中的有效碰撞原理，连接反应也是一个化学反应，当在进行连接反应时，单位时间内分子数目多的目的片段分子更加容易与载体分子接触，换言之，有效分子浓度更高，则更容易发生连接反应，同时能有效减少载体自连反应。
小片段基因载体构建时，小片段的PCR 技术又比较困难，尤其是在酶切回收步骤，也常出现酶切后的粘性末端被降解的现象[ 3 ]，因此需要采取办法避免这些常见问题。
金磊等[ 3 ]提出的新方法是基于小片段基因寡聚核苷酸合成技术和竞争性连接原理。
利用寡聚核苷酸合成的方法，省去了目的基因的酶切步骤和载体酶切后胶回收纯化步骤，解决了小片段PCR 困难的问题；利用竞争性连接原理可以克服载体自连，同时提高连接效率。
其应用该方法已经完成了4个小片段基因(67bp)表达载体的构建，连接成功率达到66.7%−100%。
证明了该方法具有简单快速、节省试剂费用和连接效率高等特点。
1.2 Micro RNA 前体PCR 置换法自1999 年Hamilton 等[ 4 ]首次发现了长度为25 nt 的RNA 中间产物后，RNAi 技术被广泛应用于植物基因功能鉴定和功能基因表达调控等各个领域。
前人的研究中构建RNAi 载体的方法主要有：传统的酶切连接法、Gateway 技术、重叠延伸PCR 法、LIC 克隆法和Golden Gate克隆法[ 3 ]。
重叠延伸PCR 技术(Gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR)，于1989年由Horton 等建立，主要方法是采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
此技术利用PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，用这一技术可以很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物[ 7 ]，如Cao 等[ 8 ]利用寡聚核苷酸合成技术和重叠延伸PCR 技术合成了布氏柠檬酸杆菌植酸酶基因，并检测了其高效的表达。
应用此方法还可以对目的基因进行小泛素相关基因的修饰，如Lu 利用这种方法对HV1 蛋白进行了泛素化修饰从而解决了此蛋白在大肠杆菌Escherichia coli 内外源表达易被降解的问题，以及泛素化修饰鸽子Aplopelia bonaparte B淋巴细胞刺激因子(do BAFF) 增强了其在大肠杆菌内的可溶性表达。
但是需要指出的是重叠延伸PCR 技术在实际应用中，经常会受到引物自身序列的限制，例如，引物同(异)二聚体的产生导致的扩增效率低下，扩增片段中的重复序列导致产物突等诸多问题[ 7 ]。
1.3 重组融合PCR 法基因的同源重组是噬菌体、细菌到真核生物都普遍存在的生物学现象[ 8 ]。
广义的同源重组是指含有同源序列的DNA 分子之间或分子之内的重新组合，同源重组严格依赖DNA 分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在DNA 复制的过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S 期之后，DNA的修复过程中也会发生同源重组的现象[ 9 ]。
以同源重组技术为基础，通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因，进而研究目的基因与表型性状间的关系，是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法[ 10--11 ]。
常用的同源重组克隆的策略包括：T4 DNA 聚合酶介导的同源重组，ExonucleaseⅢ介导的同源重组，RF 克隆等。
这些传统构建方法由于要避免目的片段中已有限制性酶切位点，而不得不选择构建中间载体或者选择昂贵且酶切效率低的非常用限制性酶，经过多次连接转化，操作麻烦，费时费力，不但大量增加了载体构建的工作量，而且实验成功得不到保证融合PCR 技术在不经过酶切和连接的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
现有的融合PCR 技术一般包括两步PCR 反应，类似于重叠延伸PCR 法和一步克隆法[ 12 ]：1)分别设计5′端带有互补序列的若干条特异性引物，分别进行各个片段的扩增；2) 随后在同体系加入各片段，以一对外侧引物进行融合片段的全长序列的扩增。
1.4 In-Fusion 试剂盒法构建载体时需要通过连接酶连接完成，而且选择酶切位点时通常会被载体上独特的酶切位点所限制[ 13 ]，因此能够摆脱酶切位点的限制，省略酶切与连接的步骤，并且能够在载体的任意位置上插入目的基因的序列是载体构建发展的新趋势。
Gateway 技术、一步克隆法等技术的出现大大简化了载体构建的步骤，但仍然没有解决酶切位点的限制等问题。
近年来的研究发现，利用In-Fusion 试剂盒(In-FusionTM advantage PCR cloning kit) 能够摆脱酶切位点的限制，利用这种方法可以对任何常用的载体进行修饰，用单酶切或者利用PCR 扩增的方法将载体线性化，使之成为一个不依赖序列和连接反应高效的基因克隆体[ 14 ]，该方法利用重叠PCR 技术在PCR 引物的5'端增加一个与线性载体两端同源的15 bp 的序列，由于序列的同源性，通过PCR 程序可将目的基因插入到载体中，实现DNA 重组。
这种方法操作简单，对目的基因和载体没有特殊的要求，可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域，不会产生反向插入的问题，没有知识产权限制[36-37]，而且适用于在多宿主中的表达[ 14 ]。
利用In-Fusion 试剂盒构建表达载体的步骤：1)质粒的线性化(单酶切或双酶切)；2)目的基因的In-Fusion 改造；3)经过In-Fusion 改造目的基因片段与线性载体在In-Fusion 酶的作用下发生重组，使目的基因连接到载体上；4)In-Fusion 产物的转化与检测；5)提取阳性克隆质粒进行PCR 和酶切验证[ 15 ]。
1.5 SLIC 法在一些基因共表达的研究中，需要构建一些大型复杂载体，将若干个目的片段依次、连续连接到目标载体上，插入片段较多，酶切位点难以选择，通常的构建方法是使用平末端连接，但是平末端连接效率低且工作量与难度较大。
Li 和Elledge 所建立的不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)[ 16 ]，把同源重组与单链退火结合起来，可以高效、定向地将任意序列的2个[ 17 ]或2个以上的DNA片段组装到一起，不需要连接反应即可完成体外的重组，避免目的基因序列中原有酶切位点对DNA 重组的限制，极大地简化了DNA 重组过程[ 18 ]。
采用SLIC 法构建复杂载体的基本步骤：1)采用PCR 扩增使载体线性化；2)在PCR的引物两端加上与载体末端同源的DNA 序列(20−30 bp)，扩增目的基因；3)用T4DNA聚合酶处理目的基因和载体片段，使其5'末端形成突出单链；4)在T4 DNA 连接酶缓冲体系中退火，形成重组中间体；5)转化大肠杆菌Escherichia coli 并筛选重组子。
1.6 Gibson 等温拼接法Gibson 等温拼接法是Gibson 等[ 19 ]报道的一种高效、快速的多基因片段拼接技术，由Gibson变温拼接法发展而来。
与SLIC 法相似，可以将任意序列的2个或2个以上的DNA 片段组装到一起，适用于复杂载体的构建。
不同的是，通过控制目的片段重叠序列的大小(40−600 bp)可以直接在体外合成得到较大的基因组序列，大大简化了大型DNA 分子合成的过程，展示了其广泛的应用前景。
采用Gibson 法构建表达载体的步骤为用两端带有与载体末端同源序列的引物PCR扩增目的基因；2)将PCR产物加入3种酶(Phusion 或Taq 聚合酶、T5 外切酶和Taq DNA 连接酶)[47-48]的混合缓冲液中；3)混合液在50 ℃恒温孵育一段时间，时间由片段长短确定。
