根癌农杆菌介导植物基因遗传转化技术

根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化1 柑桔材料的准备不同品种的柑桔胚性愈伤组织保存于MT固体培养基上，每20-25d继代一次。

侵染前转入悬浮MT（附加100μM乙酰丁香酮）培养基中培养4天后用于侵染。

2 农杆菌侵染液的制备1.农杆菌（保存在-70℃）在含有50 mg·L-卡那霉素的YEB选择培养基上划线培养，28℃暗培养。

2.长出菌落后，挑取单菌落在新的选择培养基上涂皿。

3.取出培养24小时后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100μM乙酰丁香酮）液体培养基震荡培养2个小时。

4.用分光光度计测量菌液的OD600值，并用MT液体培养基调整到 OD600=0.5～1.0进行侵染。

3侵染实验1.将悬浮培养4d的愈伤组织转入稀释菌液中浸泡20-30 min。

2.用无菌滤纸吸干表面菌液，转到MT基本培养基上，19℃共培养2～3 d。

3.共培养后的愈伤组织在无菌水中轻轻漂洗数次，直至洗液变清为止，再加入含有400 mg/L头孢霉素的无菌水浸泡20 min，倾去洗液。

4.将外植体置于无菌滤纸上吸干，转入筛选培养基（根据不同的质粒载体添加不同浓度的筛选剂），28℃暗培养。

4抗性愈伤组织的选择培养和再生（以质粒载体pCAMBIA1303为例）1.愈伤组织刚转移到筛选培养基上时，应该表现为对照逐渐褐化、死亡，转化处理的愈伤组织中转化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织。

2.将新形成的抗性愈伤组织转至新的筛选培养基上进行继代培养，当得到的抗性胚性愈伤组织达到一定量时，将一部分转入MT+甘油2%+ Cef 50 mg·L-1的胚状体分化固体培养基上。

3.有球形胚状体开始出现后，将得到的胚状体转入MT+ME 1500 mg·L-1+ Cef50 mg·L-1培养基上，使胚状体进一步长大，形成子叶型胚状体。

7-9周后，将子叶型胚状体转入MT+Cef 50 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 +BA 0.5mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上再生芽，1个月后就可见再生芽长出。

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。

下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。

T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。

不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。

置于该边界内的任何外源基因均可被转化。

LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。

LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。

其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。

该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。

3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。

它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。

二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）。

根癌农杆菌含有 Ti 质粒。

发根农杆菌含有 Ri 质粒。

根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具有一段转移 DNA （transfer DNA ，又称 T-DNA），在农杆菌侵染植物时， T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。

由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150kb 的外源基因，因此， Ti 质粒和 Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。

1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。

染色体基因包括 chvA 、chvB 、att 、pscA 、chvD 以及 chvB 。

它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。

ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白的合成水平。

ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。

原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区：（ 1） T-DNA 区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段 DNA ，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。

T-DNA 上最重要的是两端的2个边界（LB和RB），它们是T-DNA转移所必需的。

只要其存在， T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA 的右边界在 T-DNA 的整合中对于靶 DNA 位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于 T-DNA 以外的 1 个 30~40 kb 的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因（vir）。

根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。

它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。

本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。

根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。

它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。

2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。

2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。

3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。

4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。

根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。

1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。

转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。

•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。

•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。

2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。

通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。

•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展植物真菌是一类重要的微生物，在自然界中具有重要的地位，它们可以在植物体内或外引起多种作物的病害。

为了有效防治和控制植物真菌的病害，基因转化技术已经成为一种重要的手段。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术具有高效、简单、灵活等特点，在植物真菌遗传改良研究中得到了广泛应用。

本文将对根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展进行综述。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术是利用根癌农杆菌T-DNA插入真菌染色体中，实现外源基因的导入。

根癌农杆菌T-DNA在感染植物组织过程中，T-DNA的两侧的重复序列对应产生质粒的头部和尾部，T-DNA插入到植物基因组中去除了生发区和生殖区基因的调节因子，导致细胞无法分化造成根癌，自然或人工去除这些基因后，再将目的基因嵌合到T-DNA后导入目标植物组织并在细胞层或组织层产生效应。

1. 研究目的明确根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究目的是为了利用该技术将外源基因导入真菌细胞中，从而使真菌获得新的性状或功能。

目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术已被成功应用于多种真菌，如白僵菌、酿酒酵母、木霉等。

这些研究表明，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在真菌改良中具有广阔的应用前景。

2. 技术改进在根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的研究过程中，研究人员还对该技术进行了不断改进，以提高其转化效率和稳定性。

通过对根癌农杆菌T-DNA的结构和功能进行深入研究，研究人员已成功构建了一些具有高效转化能力的根癌农杆菌株系，并利用这些株系进行了真菌遗传转化研究。

研究人员还对真菌遗传转化的各个环节进行了逐一优化，从而取得了一系列令人满意的研究成果。

3. 应用领域拓展三、面临的挑战与未来展望尽管根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在植物真菌遗传改良研究中取得了一系列的进展，但在实际应用中仍然面临着一些挑战。

由于真菌的遗传特性复杂，其遗传转化技术相对于细菌和植物来说较为困难，因此对真菌的遗传机制和代谢途径的研究仍需要进一步加强。

实验七 农杆菌介导法转化烟草一、实验目的（1）了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤。

（2）掌握遗传转化的基本操作技术。

二、实验原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。

野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。

农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。

我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

三、材料、器材与药品1、材料烟草、LBA4404菌株质粒载体为pBi1212、器材摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。

3、药品MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA。

四、实验步骤1、根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在 YEP 固体培养基上，YEP 固体培养基的成分为每100ml含NaCl 0.5g、酵母 1g、水解酪蛋白 1g、琼脂 1．5g、pH7．0。

在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。

2、配制 YEP 液体培养基：成分同上，只是添加卡那霉素而不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5ml左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。

3、摇菌：用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于27℃摇床上摇菌16-17h（180r/min） ，培养至 OD600为 0．6～0．8。

二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。

根癌农杆菌含有Ti 质粒。

发根农杆菌含有Ri 质粒.根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA （transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。

由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。

1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T—DNA 以外Vir 区的基因。

染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。

它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。

ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。

ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。

原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T—DNA区:是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T—DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。

只要其存在，T—DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T—DNA的右边界在T—DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此,尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T—DNA以外的1个30～40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。

自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。

农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。

农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。

简略地说。

其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。

・综述与专论・生物技术通报Ｂ１０ＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹＢＵＬＬＥＴｌＮ２０１０年第３期根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展范亮波李梅冀颖刘卫德蒋细良（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京１０００８１）摘要：木霉作为土传植物病原茵的生防真菌，研究其功能基因具有重要的意义。

根癌农杆茵介导的遗传转化（ＡＴＭＴ）为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。

对根癌农杆茵介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。

关键词：根癌农杆茵木霉茵遗传转化Ｔ・ＤＮＡＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＭｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＦａｎＬｉａｎｇｂｏＬｉＭｅｉｊｉＹｉｎｇＬｉｕＷｅｉｄｅＪｉａｎｇＸｉｌｉａｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ如ｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｇａｉｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓｏｉｌ－ｂｏｒｎｅｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｉｔｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｉｔ＇ｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｆｏｒｗｈｉｃｈＡＴＭＴｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔ００１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｎｓ—ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴ・ＤＮＡ木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．）属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，是一种广泛存在于土壤中的丝状真菌。

根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展与对策张洁;周岩【摘要】在植物基因工程中,根癌农杆菌介导法是目前研究得较为深入、技术较为完善有效的转基因方法.但由于单子叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主,因此阻碍了根癌农杆菌介导法在单子叶植物遗传转化研究方面的应用.随着分子生物学的迅猛发展,人们对农杆菌介导法的转化机理、影响因素不断探索与研究,使根癌农杆菌介导法被逐步应用于单子叶植物中,尤其是禾本科作物,并取得突破性进展.对农杆菌转化机理与特点、影响单子叶植物转化的因素进行介绍,综述农杆菌介导法在小麦、玉米和水稻三大作物遗传改良方面的研究进展,并从超声波处理、表面活性剂、抗氧化剂和乙酰丁香酮的添加四个方面阐述提高农杆菌转化单子叶植物转化效率的对策,以期为农杆菌转化单子叶植物的进一步改进与优化提供参考.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】8页(P7-14)【关键词】农杆菌;单子叶植物;研究进展;对策【作者】张洁;周岩【作者单位】河南科技学院生命科技学院,新乡453003;河南科技学院生命科技学院,新乡453003【正文语种】中文自1983年成功获得第一例农杆菌介导的转基因烟草以来，有关农杆菌介导的基因转移的应用研究逐步发展成为植物基因工程领域的研究热点，通过农杆菌介导法转化植物的研究也日益广泛和深入。

农杆菌介导法具有转化植物受体，操作易行，经济简便，可插入大片段DNA，整合于基因组上的外源基因拷贝数少且重排程度低，技术仪器要求低，转化效率高等颇多优点。

由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，利用农杆菌介导法对单子叶植物进行遗传转化的研究因此受到限制。

Portrykus［1］曾认为农杆菌转化单子叶植物是不可能的。

禾谷科作物如水稻、小麦、玉米都是单子叶植物，是人类重要的粮食作物，利用基因工程技术对该类植物的研究具有十分重要的价值。

近年来，随着农杆菌介导法转化机制和影响因素的进一步研究以及转化方法的不断完善，农杆菌介导法已逐步发展成为大部分双子叶植物和一部分单子叶植物遗传转化的主流方法，以及植物基因工程中不可或缺的研究工具，具有极大的应用价值。

根癌农杆菌介导的植物转化－叶盘转化法一、原理以根癌农杆菌介导的遗传转化是目前最有效的途径之一。

根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。

经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。

Vir基因产物使Ti质粒上的T－DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。

插入在T－DNA左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。

二、目的了解根癌农杆菌介导的植物基因转化的方法和用途，掌握叶盘转化法的基本原理和操作。

三、材料、试剂和器具1、烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株。

2、含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

3、YEB液培养基。

4、抗菌素储备液(Kan, Cif, Rif, Amp)。

5、MS基本培养基。

6、MS分化培养基。

7、70％乙醇。

8、0.1%升汞。

四、操作步骤1、取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。

2、将无菌叶片剪成份0.5cm×0.5cm的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。

3、挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。

取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。

4、在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。

取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。

然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L, BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。

5、将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。

在光照的条件下，25℃进行选择培养。